保存されたMTMR脂質ホスファターゼは加齢に伴い脳ニューロンのオートファジーをますます抑制する

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21817 (2022) この記事を引用

1231 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

老化は、細胞損傷の生涯にわたる進行性の蓄積によって引き起こされます。オートファジー (細胞の自己食べること) は、このような損傷を分解する主要な細胞除去メカニズムとして機能しますが、その能力は年齢とともに低下します。生理学的および医学的重要性にもかかわらず、オートファジーがなぜ高齢になると多くの細胞で有害な細胞物質を効果的に除去できなくなるのかはほとんどわかっていない。今回我々は、加齢に伴うオートファジー分解の欠陥がプロセスの初期段階と後期段階の両方で発生することを示す。さらに、ショウジョウバエのキイロショウジョウバエでは、オートファジー抑制因子として知られるミオチューブラリン関連（MTMR）脂質ホスファターゼである卵由来チロシンホスファターゼ（EDTP）が、成体になるまでに脳ニューロンに徐々に蓄積します。加齢に伴う EDTP 活性の増加は、EDTP 遺伝子座における DNA N6 アデニンのメチル化の増加と関連しています。ヒトの EDTP に相当する MTMR14 も、年齢とともに脳のニューロンに蓄積する傾向があります。したがって、EDTP、およびおそらくMTMR14は、成人期を通じてオートファジーをますます抑制することにより、脳の老化を促進します。我々は、EDTPおよびMTMR14ホスファターゼが、環境要因とはほぼ独立してニューロンの老化速度を設定する内因性老化促進因子として機能し、オートファジーが昆虫のDNA N6-メチルアデニンレベルの影響を受けることを提案する。

細胞損傷の蓄積は、本質的にすべての老化細胞の特徴です1、2、3、4、5、6、7。このような損傷には主に酸化、凝集、誤って折りたたまれた（つまり機能しない）タンパク質が含まれ、細胞プロセスや恒常性を妨害し、それによって影響を受けた細胞の老化とその後の損失を引き起こします。大量の細胞死は、加齢に伴うさまざまな変性病態、特に神経変性疾患の発症につながる可能性があります。したがって、損傷したサイトゾル物質を効果的に除去することは、主にニューロンのように最終分化して増殖能力を失った細胞の長期的な作動と生存にとって極めて重要です。

オートファジーは真核細胞の主要な異化プロセスとして機能し、これにより細胞損傷を効果的に除去できます8、9、10、11、12。オートファジー中、細胞質の一部は酸性加水分解酵素による分解のためにリソソームに送られます。オートファジーの積荷がリソソーム区画に送達されるメカニズムに応じて、オートファジーは 3 つの主要なタイプ、すなわちマイクロオートファジー、シャペロン媒介オートファジー、およびマクロオートファジーに区別されます。マクロオートファジー (以下、オートファジーと呼びます) には、分解される運命にある細胞質物質を隔離するために、オートファゴソームと呼ばれる二重膜結合小胞の形成が含まれます。その後、オートファゴソームはリソソームと融合してオートリソソームを形成し、最終的にそこで酵素による分解が起こります (図 1、A)。オートファジープロセスの欠陥は、さまざまな神経変性病理の発症に関与しています9、13、14。このことは、成人初期と比較して、高齢者のニューロンではオートファジーの効果が低下する可能性を高めています。線虫 Caenorhabditis elegans とショウジョウバエ Drosophila melanogaster では、オートファジーの作動レベルが若い成体よりも高齢の動物で著しく低いことが実際に判明しました 15、16、17。この加齢に伴うオートファジー能力の低下は、重要なオートファジー関連 (Atg) 遺伝子である Atg8/LC3B (微小管関連タンパク質 1A/1B 軽鎖 3B) の発現低下を伴います。Atg8/LC3B は、細胞の増殖に必要なユビキチン様タンパク質をコードしています。オートファジー膜構造の形成18。オートファジーの生理学的および医学的重要性にもかかわらず、なぜ年齢とともにニューロンのオートファジーの能力が低下するのかはまだほとんどわかっていません。個々のニューロンのゲノムにある Atg 遺伝子のランダムな不活性化変異を含む確率的過程は、確実に崩壊に寄与するはずです 6,7。まだほとんど解明されていない規制要因も関与している可能性があります。最近の研究によると、ルビコン（RUNドメインとシステインリッチドメインを含む、Beclin 1相互作用タンパク質）は、Beclin 1（コイルドコイルのミオシン様BCL2相互作用タンパク質）を含むタンパク質複合体と相互作用することでオートファジーを阻害する。 Vps15/p150 (液胞タンパク質選別 15)、PI3K (クラス III ホスファチジルイノシトール 3 キナーゼ)、および UVRAG (紫外線照射耐性関連遺伝子) は、線虫、ハエ、およびマウスの老化中のプロセスをますます下方制御します 19。しかし、なぜルビコンが年齢とともにさまざまな細胞型に徐々に蓄積するのかは未解決のままです。

ショウジョウバエの脳では、加齢とともにオートファジーの能力が徐々に低下します。 (A) 哺乳類のマクロオートファジーのプロセス。オートファジー中、不要な細胞質成分 (タンパク質とミトコンドリアが示されています) は、オートファゴソームと呼ばれる二重膜結合小胞に隔離されます。オートファゴソームは、ファゴフォア膜の伸長と融合によって形成されます。このスキームは、Atg5、クラス III PI3K、Atg8/LC3B-II、および SQSTM1/p62 オートファジーマーカーがプロセス中にどこでその効果を発揮するかを示しています。 Atg5 と PI3K (後者は 2xFYVE-GFP で示されます) はプロセス (ファゴフォア形成) の初期段階を標識し、Atg8/LC3B-II はファゴフォアとオートファゴソームの両方を示します。一方、p62 はオートファジー分解の基質として機能するアダプタータンパク質です。 Atg8-I: 可溶型。 Atg8-II: 膜結合型。システインプロテアーゼ Atg4 は、オートファゴソームが形成されるときに、オートファゴソーム膜から Atg8-II を脱結合させます (つまり、Atg8-II から Atg8-I への変換を媒介します)。 MTMR14 は、クラス III PI3K 複合体に拮抗することでオートファジー膜の形成を阻害します。棒は負の制御相互作用を示し、矢印は活性化を示します。 (B) ショウジョウバエ成虫の脳における Atg5- (1 行目)、2xFYVE-GFP- (2 行目)、eGFP-Atg8a (3 行目)、および Ref(2)P/p62 陽性構造 (4 行目) のレベル。さまざまな年齢。 Atg5 および 2xFYVE-GFP は、初期のオートファジー構造、ファゴフォア、および発生期のオートファゴソームを標識します。各列で、蛍光顕微鏡画像が同じ露光時間で取得されました。 2xFYVE-GFP の場合、GFP タグ付き導入遺伝子が使用され、それ以外の場合は特異的抗体が使用されました。スケールバーは 25 μm に対応します。ヘキスト染色 (青) は核を示します。 (B'–B'''') Atg5、2xFYVE-GFP、eGFP-Atg8a、および Ref(2)P 陽性構造の定量化。 (C) 異なる成体の段階で解剖された全頭部抽出物中の相対的な Ref(2)P および Atg8a-I/II レベルを示すウェスタンブロット分析。 Atg8a-II はファゴフォアとオートファゴソームを標識します。 α-Tub84Bを内部対照として使用した。 (C、C'') ウェスタンブロット分析によって決定された相対 Ref(2)P 密度、および相対 Atg8-I および Atg8-II レベルの定量化 (C)。パネル (B'–B'''')、(C')、および (C'') では、プロット上のボックスはサンプルの最も典型的な 50% を表し、線は中央値を示し、上ひげと下ひげは残りの 25% を示しています。サンプルの 25%。丸は外れ値を示します。 *P < 0.05; **P < 0.01; *** 1 日目との各比較で P < 0.001。統計については、「材料と方法」を参照してください。

初期のオートファジー膜構造の形成には、クラス III PI3K 酵素によって PI から変換されるホスファチジルイノシトール 3-リン酸 (PI3P) などの特定のホスホイノシチド (PI) 誘導体が必要です (図 1A)20。 PI3K は、Vps34 (液胞タンパク質選別) とも呼ばれ、オートファジー小胞核形成複合体のメンバーです。通常の条件下では、哺乳類のミオチューブラリン関連脂質ホスファターゼ MTMR14 とそのショウジョウバエオルソログ EDTP (卵由来チロシンホスファターゼ) は PI3K/Vps34 に拮抗して、オートファジーの有害な過剰活性化を防ぎます 21,22,23。 MTMR14 は、PI3P を PI24 に変換することで基礎オートファジーを阻害します。 MTMR14 または EDTP が欠損した遺伝的背景では、PI3P に富んだ構造の量が対照と比較して増加します 22,25。 MTMR14 は、オートファジーのこの初期段階に加えて、プロセスの後期段階であるオートファゴソームとリソソームの融合も制御します (図 1A)22。この研究では、EDTP と MTMR14 が年齢とともに脳ニューロンにますます蓄積することを示します。これらの保存されたMTMR脂質ホスファターゼは、年齢に依存したニューロンのオートファジーの低下に寄与し、それによって脳の老化を促進します。

オートファジーが加齢とともにどのように低下するかをよりよく理解するために、我々はまずショウジョウバエの成体寿命中のオートファジー活性の相対レベルを測定しました。オートファジーの初期段階をモニタリングするために広く使用されている 2 つのマーカー、Atg5 と 2xFYVE ドメイン (図 1A)26,27 は、さまざまな生活段階のハエ成虫から分離された脳内での蓄積レベルが徐々に減少することを示しました (図 1B–B'')。 Atg5 はファゴフォアと呼ばれる成長中の隔離膜の伸長に役割を果たすため、そのレベルは構造の量と相関します 28。 FYVE ドメインは PI3P に結合するため、その量は PI3K/Vps34 活性に比例します 29。これらのマーカーの適用により、生物の老化に伴って脳ニューロンにおけるファゴフォア形成が徐々に低下することが明確に実証されました。また、オートファジー膜結合型 Atg8a、Atg8a-II30 の量も評価しました。内因的に発現された eGFP-Atg8a レポーター 31 によって標識された Atg8a 陽性オートファジー構造の量は、成人の生涯にわたって脳内で徐々に増加しました (図 1B-B‴)。 eGFP は低 pH に敏感であるため、酸性コンパートメントでは不活性となり、そのためファゴフォアとオートファゴソームは標識されますが、オートリソソームは標識されません。ウェスタンブロット分析を使用して、さまざまな段階の成体動物に由来する脳抽出物中のAtg8a-IIレベルをテストした場合にも、同様の結果が得られました（図1C、C''）。 Atg8a-II とは対照的に、非結合型可溶型 Atg8a (Atg8a-I) のレベルは、成人期を通じてほぼ一定のままでした。これらのデータは、ファゴフォア形成の低下にもかかわらず、成人の生涯にわたってオートファゴソームの生成速度が徐々に増加したことを示しています。あるいは、分解プロセスの後期段階にも影響があり、オートファゴソームまたは非消化性オートリソソームの正味の蓄積が引き起こされました。おそらく、オートファゴソームとリソソームの融合、リソソームの酸性化、またはオートリソソーム内容物の分解が影響を受ける段階です。

上記の 2 つの選択肢を区別するために、ヒト p62/SQSTM1 (シークエストソーム 1) に相当するハエである Ref(2)P の成体寿命中の量を評価しました 15。 p62/SQSTM1 はオートファジー分解の基質として機能するため (このタンパク質はカーゴを膜結合 Atg8/LC3B に結合します)、そのレベルはオートファジー活性に反比例します 32,33。 Ref(2)P 特異的抗体を使用して、さまざまな成体段階で解剖された脳サンプルの免疫組織化学的分析を行ったところ、動物が高齢になればなるほど、抗体によって標識された不溶性タンパク質凝集体の量が増加することがわかりました（図 1B、 B"")。これらの結果を強化するために、同じ Ref(2)P 特異的抗体を使用して、その後のウェスタンブロット分析を全頭サンプルに適用しました。蛍光顕微鏡で得られたデータと一致して、頭部抽出物中の可溶性 Ref(2)P タンパク質の量は加齢とともに徐々に増加しました (図 1C、C')。まとめると、これらの結果は、老化中にオートファジー分解がプロセスの 2 つの段階で損なわれることを意味します。まず、Atg5 および PI3P レベルの低下によって明らかなように、ファゴフォアが形成および成長する小胞核形成時です。第二に、オートファゴソーム形成後、構造がリソソームと融合するか、オートリソソーム内容物が酵素的に消化されると、Atg8a-II 蓄積の増加によって示されます。私たちは、オートファゴソーム形成の抑制とオートリソソーム機能の低下の累積的な影響により、脳ニューロンにおけるオートファジーは年齢とともに徐々に低下すると結論付けています。

MTMR14 は、プロセスの初期段階 (ファゴフォア形成) と後期段階 (オートリソソーム形成) の両方でオートファジーに影響を与えることが示されています (図 1A、2A)。さらに、我々は以前、EDTP がショウジョウバエの脂肪体の基礎オートファジーを効果的に阻害すること 23,25,34 と、MTMR14 がヒト大脳皮質に豊富に蓄積することを実証しました 35。ここで我々は、Atg8a-II および Ref(2)P レベルが EDTP 過剰発現の遺伝的背景では増加するが (図 2B–B‴)、EDTP 低型変異体の背景では低下することを明らかにしました (図 2C–C‴)。さらに、EDTPの過剰発現により、ユビキチン化構造の量が大幅に増加しました（図S1A-A'）。これは、通常の条件下では、EDTP が Atg8a 脂質化後のオートファゴソーム形成時だけでなく、オートファジーも阻害することを示唆しています。

EDTP の過剰活性はショウジョウバエの脳におけるオートファジー活性を阻害しますが、EDTP 欠乏はオートファジー活性を高めます。 (A) ショウジョウバエ EDTP および哺乳動物 MTMR14 脂質ホスファターゼの酵素機能。 2 つのタンパク質は PI3P を PI に変換し、それによってオートファジー膜の形成に拮抗します。 (B) ウェスタンブロット分析は、対照と比較して、EDTP を過剰発現する遺伝的背景における EDTP および Ref(2)P レベルの上昇を示します。 Atg8a のオートファジー膜結合型 (Atg8a-II) も、Atg8a の可溶性 (非結合) 型を表す Atg8a-I と比較して増加します。 (B'–B‴) ウェスタンブロット分析によって決定された相対的な EDTP、Ref(2)P、Atg8a-I および Atg8a-II レベルの定量化 (B)。 (C) ウェスタンブロット分析は、EDTP、Ref(2)P、および Atg8a-II/Atg8a-I 比の相対レベルが、対照と比較して、EDTP 欠損 (亜型変異体) 遺伝的背景においてそれぞれ減少することを明らかにします。 (C'–C‴) ウェスタンブロット分析によって同定された相対 EDTP、Ref(2)P、Atg8a-I および Atg8a-II 密度の定量化 (C)。パネル B および C では、メスのショウジョウバエの頭部からタンパク質を抽出し、αTub84B を内部対照として使用し、動物を 29 °C で維持しました。プロットでは、ボックスはサンプルの最も典型的な 50% を表し、線は中央値を示し、上ヒゲと下ヒゲはサンプルの残りの 25 ～ 25% を示しています。丸は外れ値を示します。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001。統計については、「材料と方法」を参照してください。

オートファジー制御における EDTP の神経細胞の役割をより深く理解するために、29 °C に維持した生後 7 日および 21 日の成人における mCherry-Atg8a および GFP-Lamp1 (リソソーム構造特異的) レポーターの共局在をモニタリングしました (図.3A、A'および図S1B–B‴）。 EDTP サイレンシング (EDTP-RNAiV22) および過剰発現 (EDTPGSV6) はそれぞれ、同じ年齢の対照と比較して、高齢動物におけるこれらのマーカーの共局在を増加させました。対照遺伝子型では、両方のマーカーによって標識された構造の量は、若者よりも高齢者の方が有意に多かった（図3A''-A‴および図S1B'）。 EDTPダウンレギュレーションは増加しましたが、EDTP過剰活性は減少し、mCherry-Atg8aおよびGFP-Lamp1特異的構造の数が減少しました（図3A''、A‴および図S1B'）。 Atg8a の脂質化型 (Atg8a-II) はオートファジー分解の基質であり、mCherry レポーターはオートリソソームの酸性環境に耐えます 36,37。これは、EDTP 欠損が蛍光顕微鏡アッセイではオートリソソーム (mCherry-Atg8a 陽性構造) の量を増加させるが、ウェスタンブロット分析では Atg8a-II レベルを減少させる理由を説明できます (図 3A、A'' および図 2C、C‴)。。したがって、EDTP の過剰発現は、オートファジー構造の生成を少なくすることでオートファジーを阻害する可能性があります。これらの構造はリソソームと融合することができますが、分解プロセスは損なわれているようです（Atg8a-IIレベルの蓄積とmCherry-Atg8a-GFP-Lamp1の共局在の増加によって示されるように）（図2、3）。 MTMR タンパク質は、PI(3,5)P238 などのオートファジーに関与する脂質を脱リン酸化することが知られています。PI(3,5)P238 は、リソソームの酸性化 39 やリソソーム生合成 40 など、オートファジープロセスの下流段階に必要です。我々の結果によれば、EDTPはニューロンにおける小胞核形成（拮抗するVsp34複合体を介して）とリソソーム分解を同時にブロックする可能性がある。

EDTP は、ショウジョウバエの脳におけるオートファジー小胞の核形成と酸性分解の両方を阻害します。 (A) ショウジョウバエ成体の脳のニューロンにおける GFP-Lamp1 (緑色) と 3xmCherry-Atg8a (赤色) レポーターの共局在を示す蛍光画像。黄色の矢印は、両方のマーカーによってラベル付けされた構造を示します。白い四角は拡大された領域を示します。図には、成体期の 7 日および 21 日の動物に由来するサンプルの統計データが示されています (A'-A‴)。動物は 29 °C に維持されました。プロットでは、ボックスはサンプルの最も典型的な 50% を表し、線は中央値を示し、上ヒゲと下ヒゲはサンプルの残りの 25 ～ 25% を示しています。丸は外れ値を示します。 P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001。統計については、「材料と方法」を参照してください。

関連する文献データと上記の結果により、成人の生涯を通じて脳ニューロンにおけるこれらの保存されたMTMR脂質ホスファターゼの成人期に関連する相対レベル（すなわち、蓄積動態）を調べることが促されました。この目的を達成するために、成人の生涯にわたる脳内の EDTP 蓄積を分析しました。 EDTP発現は、最初に蛍光遺伝子トラップシステムによって監視されました。このシステムでは、トロイの木馬EDTP-Gal4ドライバーがEDTP遺伝子の最初のイントロン配列に挿入され、UAS-myr-GFPレポーター活性を制御します（図S2A）。 EDTP 活性は、臓器内で加齢に伴う緩やかな増加を示しました (図 4A、A')。若年成人（10日目）と高齢者（60日目）の間では、ほぼ3倍の差が検出されました。この加齢に伴うEDTP転写の変化は、キノコ小体、食道下神経節、触角葉と呼ばれる脳構造で特に顕著であり（図3Aおよび図S1B）、EDTPを蓄積するニューロン数の増加は伴わなかった（図S1B）。 S2C、C')。老化中に、キノコ体の領域のオートファジーマーカーのレベルが大幅に変化しました。 2xFYVE-GFPによって標識された構造の量は減少しましたが、Ref（2）Pレベルは増加しました（図S2D – E '）。頭部サンプルの定量的 PCR 分析でも、若い動物と比較して高齢の動物の方がより多量の EDTP 転写産物を示しました (図 4B)。これらの結果は、動物の加齢に伴って脳ニューロンのEDTP転写レベルが徐々に増加することを明らかにしており、これはショウジョウバエの老化中に上方制御または下方制御される遺伝因子を同定した以前のゲノムワイド遺伝子発現解析と一致している。

EDTP は、ショウジョウバエの成虫の生涯を通じて脳構造内でますます発現します。 (A) 成人期のさまざまな段階で解剖された脳内の EDTP トロイの木馬遺伝子 (EDTP の転写活性) トラップシステムの発現を示す蛍光顕微鏡画像 (日数を示す)。画像は同じ露光時間で撮影されました。ヘキスト染色 (青) は核を示します。赤いアスタリスクは、分析から除外された延髄 (強く光る) を示します。スケールバーは 100 μm に相当します。白い点線は、分析が実行された脳セクションの輪郭を示しています。 (A') さまざまな年齢のハエ成虫の脳における相対的な EDTP 発現レベルの定量化。 (B) 脳抽出物の qPCR 分析は、EDTP 転写レベルが若年者 (10 日目) の成人よりも高齢者 (50 日目および 60 日目) の方が高いことを示しています。 (C) ウェスタンブロット分析により、EDTP はショウジョウバエ頭部抽出物中に加齢とともに蓄積する傾向があることが明らかになりました。 αTub84Bを内部対照として使用した。 (C') ウェスタンブロット分析 (C) によって決定された、さまざまな成人段階での頭部抽出物中の相対 EDTP レベルの定量化。動物は 25 °C で維持されました。パネル (A'))、(B)、および (C')) では、ボックスはサンプルの最も典型的な 50% を表し、線は中央値を示し、上ヒゲと下ヒゲはサンプルの残りの 25% ～ 25% を示しています。。丸は外れ値を示します。 1 日目との各比較で *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。統計については、「材料と方法」および表 S1 を参照してください。 (D) ショウジョウバエでは、EDTP 遺伝子座における N6-アデニンのメチル化が加齢とともに徐々に増加します。さまざまな成人段階における EDTP 遺伝子座の相対 N6-メチルアデニン (6 mA) レベル。 (D') EDTP 部位における相対 6 mA レベルの定量化。動物は 29 °C に維持されました。パネル (D') では、7 日目との各比較で *P < 0.05、** P < 0.01。

次に、EDTP 特異的抗体を使用して、全頭抽出物中のタンパク質の量をテストしました。この抗体は野生型で EDTP を標識できましたが、EDTPMI08496 変異体のバックグラウンドで EDTP 陽性バンドをマークすることはほとんどできませんでした (図 2C-C‴)。実施されたウェスタンブロット分析により、成人期にEDTPが頭部にますます蓄積する傾向があることが明らかになりました（図4C-C'）。したがって、ショウジョウバエの脳では、EDTP 活性は年齢とともに徐々に増加します。

脳ニューロンにおいて加齢とともにEDTP発現が増加する理由を理解するために、我々は成人期を通じてEDTP遺伝子座におけるN6-メチルアデニン（6mA）DNA修飾の変化を調べた（一般に、N6位のアデニンのメチル化は、影響を受けた遺伝子座での転写を促進する）。 GATC 配列を含む任意のゲノム部位における相対 6 mA レベルは、ゲノム DNA のメチル化感受性 DpnI 酵素消化と標的部位の PCR 増幅を含む PCR ベースの方法によって評価できます (図 4D)。標的部位の相対的な6 mAレベルは成人の生涯にわたって上昇する傾向があり、6 mAレベルの低下は成人の最新段階でのみ見られることがわかりました（図4D-D'）。したがって、加齢に伴う EDTP 発現の変化、およびその結果としてのオートファジー活性の変化は、この生物においてエピジェネティックに決定される可能性があります。興味深いことに、ヒトMTMR14遺伝子の場合、同様の変化は検出できませんでした（データは示されていません）。

欠陥のある動きは、老化したハエの特徴です2、3、30、39、41。移動運動はニューロンによって調整されているため、さまざまな成体段階で対照動物とEDTP欠損（つまりオートファジーが過剰に活動している）動物の登坂能力を調べました。 EDTP の下方制御は、ple-Gal4 ドライバーと 2 つの独立した効果的に機能する RNAi 構築物、EDTP-RNAi(V22) および EDTP-RNAi(dsRNA) を使用することにより、ドーパミン作動性ニューロンにおいて特に達成されました (「材料と方法」および図 S3A を参照) -D'、S4A-A')。両方の処理により、動物が一定期間内にガラスバイアルの壁に登る能力が大幅に増加しました（図5A、A'、および図S3A'）。 EDTP-RNAi(dsRNA)構築物の場合、運動の改善は、成体後期(21日目および28日目、図5A、A')でも明らかであった。これらの結果から、我々は、特定のニューロンにおけるオートファジー活性の加齢に伴う低下が、高齢者の運動障害の一因となっており、この影響は、影響を受けたニューロンにおけるEDTP欠損によって大幅に遅延または減弱される可能性があると結論づけた。対照実験では、若年成人段階と高齢成人段階の両方で、影響を受けた細胞内の2xFYVE-GFP陽性初期オートファジー構造の数がEDTP過剰活性が低下する一方で、EDTPダウンレギュレーションが著しく増加したことは注目に値します（図S5）。

ニューロンにおけるEDTPの下方制御は、登攀能力を向上させ、脳内のタンパク質のユビキチン化を低下させ、寿命を延ばすことができます。（A – A'）2つの異なるRNAiコンストラクトを使用して（図S2B、B'も参照）、ドーパミン作動性ニューロンでEDTPが下方制御されました。ハエを 29 °C で維持し、eGFP-RNAi (ON ターゲットフリー UAS 導入遺伝子制御を示す) および EDTP-RNAi は、ドーパミン作動性ニューロンのみで発現される ple-Gal4 ドライバーによって駆動されました。 (B) さまざまな段階（7 日および 21 日）の成虫のハエの脳におけるユビキチン化タンパク質（緑色の凝集体）の蓄積を示す蛍光画像。 eGFP-RNAiを対照として使用した。ヘキスト染色 (青) は核を示します。動物は 29 °C に維持されました。スケールバーは 40 μm を表します。 RNAi 構築物は Appl-Gal4 によって駆動されました。 (B') 2 つの異なる成人段階におけるユビキチン化タンパク質の定量。 (C) eGFP-RNAi (ON-target free RNAi control) 対 EDTP-RNAi(dsRNA) (EDTP はドーパミン作動性ニューロンで特異的に下方制御された) ハエのカプラン・マイヤー寿命曲線。動物は 25 °C で維持されました。 (C') パネル (C) に示されている動物の平均寿命データ。 (D) eGFP-RNAi (ON-target free RNAi control) と EDTP-RNAi(V22) および EDTP-RNAi(dsRNA) (EDTP はドーパミン作動性ニューロンでのみ下方制御された) 動物のカプラン・マイヤー寿命曲線。ハエは 29 °C で維持されました。 (D') パネル (D) に示されている動物の平均寿命データ。パネル (A)、(A')、(B')、(C')、および (D') では、ボックスはサンプルの最も典型的な 50% を表し、線は中央値を示し、上ヒゲと下ヒゲは残りを示しています。サンプルの 25% ～ 25%。丸は外れ値を示します。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、統計分析は「材料と方法」に記載されているように実行されました。統計については表 S1 を参照してください。

高齢者では、細胞質タンパク質がユビキチン化されることが多く、この分子マークは標識因子がプロテアソームまたはオートファジー分解を受けるのを助けます。私たちは、本質的にすべてのニューロンで活性な汎ニューロンAppl-Gal4ドライバーを使用して、正常脳サンプルとEDTP欠損脳サンプルにおけるユビキチン化タンパク質の加齢に伴う蓄積をテストしました。対照サンプルでは、ユビキチン標識構造のレベルは加齢とともに大幅に増加しましたが、この変化はEDTPの下方制御によって効果的に抑制されました（図5B、B'）。 EDTPの下方制御により、29°Cで維持された21日齢の動物では、mCherry-Atg8aおよびGFP-Lamp1陽性構造の量が増加し（図S3C–D'）、Ref（2）Pレベルが大幅に減少しましたコントロールあり（図S4C–D'）。したがって、EDTP 機能の阻害によるオートファジー活性の増強は、損傷したタンパク質の蓄積からニューロンを保護します。これは、さまざまな神経変性病態における一般的な特徴です。

オートファジーは老化プロセスの制御において中心的な役割を果たしており 2,3,4,43 、老化は特定のニューロンで作用するシグナル伝達システムによって制御されている 16 ため、我々はドーパミン作動性ニューロン特異的 EDTP 下方制御が寿命に及ぼす影響もテストしました。 EDTPは、ple-Gal4ドライバーと2つの独立したRNAiコンストラクトを使用することにより、成人期に特異的に下方制御されました（図S3A-B';動物は25または29°Cで継続的に保管されました）。 EDTPが下方制御された動物は、テストした両方の温度で対照よりも長生きすることが観察されました（図5C〜D'および表S1）。これらの結果は、EDTP欠乏によるドーパミン作動性ニューロンのオートファジー活性の増強が長寿効果につながる可能性があることを示唆しています。対照的に、EDTPの過剰発現は寿命を制限し、登攀能力を妨げます（図S6A、A'）。

脳の老化におけるこのMTMR脂質ホスファターゼファミリーの調節的役割が進化的に保存されているかどうかという問題に取り組むために、我々は次に、ヒトの脳ニューロンにおけるオートファジー活性とMTMR14蓄積の年齢依存性変化をモニタリングした。 p62/SQSTM1 レベルは、さまざまな成人年齢（中年および老年）で分離されたヒトの死後脳サンプルで最初に測定されました。我々は、このタンパク質が若い人（40〜55歳）よりも高齢者（70〜80歳）の方が脳ニューロンに豊富に蓄積することを発見しました（図6A、A'、および表S2）。したがって、オートファジーの能力の段階的な低下は、ヒトの脳の老化中にも起こる可能性があります。オートファジー活性のこの負の変化を考慮すると、非増殖ニューロンが細胞損傷を徐々に蓄積する傾向があり、時間の経過とともに細胞破壊に敏感になり、高齢になるとさまざまな神経変性状態の発症につながる理由を説明できます。

ヒトの SQSTM1/p62 と MTMR14 は加齢とともに脳ニューロンに蓄積します。 (A) 42 歳 (左) および 71 歳 (右) の死後の人間の脳サンプルにおける SQSTM1 の蓄積 (緑色) を示す蛍光画像。白いボックスは拡大された領域を示します (右)。画像は同じ露光時間で撮影されました。 DAPI 染色 (青) は核を示します。免疫組織化学にはヒト SQSTM1 特異的抗体を使用しました。 (A') 成人のさまざまな段階におけるヒトの脳サンプルにおける SQSTM1 レベルの定量化。 SQSTM1 は、若いサンプルと比較して、古いサンプルでより豊富に蓄積します。 (B) 「若い」(上、SKO20、27 歳) の側頭皮質 (BA 38) の第 3 層にある DAPI (青) による NeuN (緑)-MTMR14 (赤) 二重免疫染色ニューロン。共焦点蛍光顕微鏡で撮影された「高齢者」（下、SKO18、85歳）の被験者。 NeuN 免疫陽性細胞は緑色、MTMR14 免疫陽性ドット (小さな白い矢印) は赤色、核は青色です。白い点線のボックスは拡大領域 (右) を示し、右パネルの写真は赤いチャネル (MTMR14 免疫標識) を示します。黄色の矢印は自己蛍光リポフスチン (紫色の滴) を示します。リポフスチンは両方のサンプルに存在しますが、「古い」被験者の方が豊富です。 MTMR14 標識されたドット (赤い矢印) が細胞体と樹状突起に見られます。スケールバーは 10 μm に相当します。 (B') 症例別の細胞面積のパーセンテージで表した、MTMR14 免疫陽性によってカバーされる面積の箱ひげ図。 MTMR14免疫染色した側頭皮質切片の3d層の細胞においてMTMR14陽性を測定した。このプロットは、MTMR14 免疫陽性の領域が若い被験者よりも高齢の被験者の方が高いことを示しています。ほとんどの場合、細胞間の個体差が大きいことに注意してください。 6人の被験者は、27、55、61歳の被験者を含む「若中年層」と、72、77、85歳の被験者を含む「高齢者」の2つのグループに分けられた。 2 つのグループは、t 検定によって有意に異なります。 (C) MTMR14 がヒトの皮質サンプルにおいて加齢とともに蓄積する傾向があることを示すウエスタンブロット分析。 GAPDHを内部対照として使用した。 (C') ウエスタンブロット分析 (C) によって決定された、中年および高齢者グループにおける EDTP タンパク質レベルの定量化。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。統計については、表 S1 を参照してください。 (D) RT-qPCR 分析は、ヒト皮質における MTMR14 mRNA レベルが年齢とともに増加することを示しています。 GAPDHを内部対照として使用した。 3 人の中年者 (47 ～ 58 歳) と 3 人の高齢者 (85 ～ 94 歳) を比較しました。グループはマンホイットニー U 検定によって有意に異なります。サンプルの詳細については、表 S5、***P < 0.001 を参照してください。 (E) RT-qPCR を実行して、前頭前皮質サンプルの MTMR14 mRNA レベルを評価しました。さまざまな品種の9人の若い個体（1〜3歳）と6人の高齢者（13〜17歳）が比較されました（サンプルデータについては、表S6を参照）。市販の TaqMan アッセイを使用して、イヌ MTMR14 オルソログ (ThermoFisher、Cf02682018_g1) を標的にしました。 GAPDH (グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ) を参照遺伝子として使用しました (Cf04419463_gH)。プロットでは、ボックスはサンプルの最も典型的な 50% を表し、線は中央値を示し、上ヒゲと下ヒゲはサンプルの残りの 25 ～ 25% を示します。丸は外れ値を示します。 **P < 0.01、独立した 2 サンプルの t 検定。 (F) EDTP/MTMR14 脂質ホスファターゼが脳の老化にどのように影響するかを示すモデル。 EDTP/MTMR14 活性 (赤色の曲線) は、成人の生涯を通じてニューロン内で徐々に増加し、それによって生物の年齢が上がるにつれてオートファジーを徐々に下方制御します (緑色の曲線)。その結果、ニューロンでは年齢とともに細胞損傷がますます蓄積します（灰色の曲線）。緑色と灰色の破線は、それぞれオートファジーとMTMR14/EDTP活性の相対的な生理学的（基礎）レベルを示します。黄色の線は、EDTP 遺伝子座での相対 6 mA レベルを示します。成体後期では、2 つの脂質ホスファターゼが内因性老化促進因子として機能します。

HeLa 細胞および C2C12 (マウス筋芽細胞) 細胞では、MTMR14 がオートファジー構造に局在することが示されています 22。今回我々は、さまざまな年齢のヒト患者の脳皮質におけるMTMR14陽性粒子の量をテストした。ヒトMTMR14特異的抗体を使用して免疫組織化学的分析を行ったところ、ショウジョウバエで発見されたものと同様に、脳ニューロンでもMTMR14標識構造の量が年齢とともに増加することが実証されました（図6B、B'、および表S3)。これらの結果は、非認知症患者由来の脳サンプルの独立したセットに別のMTMR14特異的抗体を適用する並行分析によって確認されました（図S7A、A'、および表S4）。その後、ヒト大脳皮質サンプル中の可溶性MMR14レベルを定量化するために、その後のウエスタンブロット分析がさらに行われ、中年（47～58歳）のサンプルと比較して、高齢のサンプル（85～94歳）の方がはるかに高い強度が観察されました（図） .6C、C'、図S7B、および表S5)。これらのサンプルのMTMR14転写レベルもqPCR分析を使用して決定され、結果によると、遺伝子は若いサンプルよりも古いサンプルでより高いレベルで発現されました（図6D、図S7C、および表S5）。したがって、MTMR14 の転写制御は、高齢者における遺伝子産物のレベル (活性) の向上に寄与している可能性があります。これらの後者の結果は、GTExPORTAL（https://gtexportal.org）で自由に入手できるヒト大脳皮質特異的発現データと相関しており、それによると、MTMR14は男女ともに年齢とともに発現が増加しています（図S7D）。

MTMR14発現が別の哺乳類種の脳皮質における加齢に伴う増加を示すことを明らかにするために、我々は最終的に若齢犬と高齢犬のMTMR14のmRNAレベルを測定した（図6Eおよび表S6）。結果は、MTMR14 が若い動物と比較して高齢の動物でより活性であることを示しました。総合すると、若年成人と比較して高齢者のニューロンにおけるオートファジー活性の低下は、生涯にわたるMTMR14蓄積の増加の結果である可能性があります。

この研究では、オートファジー分解の基質として機能するショウジョウバエのRef(2)Pタンパク質とヒトのp62タンパク質が、加齢とともに脳内に徐々に蓄積することを示した（図1B、B''''、C、C'、および6A、A'）。。 Ref(2)P/p62 レベルのこの緩やかな変化は、この器官におけるオートファジー能力の加齢に伴う低下を示しており、なぜニューロンが成体後期を通じて細胞損傷を蓄積し、老化とその後の死に敏感になるのかを説明しています。さらに、高齢になるとオートファジーが 2 つの異なる段階で損なわれることを実証しました。まず、ファゴフォア/オートファゴソームが形成される初期段階です (図 1B–B'')。第二に、後の段階では、オートファゴソームがリソソームと融合するか、オートリソソーム内容物が酸性加水分解酵素によって分解されます（図 1B–C''）。これらの結果は、老化中のオートファジーの障害が、少なくとも部分的には調節（遺伝）機構に起因することを示唆しています。

オートファジーは老化制御において中心的な役割を果たしています2、3、4、44。それは損傷した細胞質成分の除去を媒介し、その活性は、インスリン/IGF1 (インスリン様成長因子) や TOR (ラパマイシンのキナーゼ標的) シグナル伝達、ミトコンドリア呼吸器系など、すべてではないにしてもさまざまな長寿経路の影響を受けます。、およびカロリー制限の基礎となる分子装置43。老化した生物のオートファジーを下方制御する遺伝子は、確かに臓器や組織の劣化に寄与し、それによってさまざまな加齢に伴う変性疾患の発症を促進します。しかし、これらの制御システムの作動は、食物の入手可能性、酸素濃度、温度などの環境要因に大きく依存しており、オートファジー分解が起こらないはずの生殖細胞系やがん幹細胞などの非老化細胞であってもオートファジーに影響を及ぼします。取り消し不能にオフになります。私たちは、老化する体細胞においては、環境要因とはほとんど関係なく、老化中にオートファジーの能力が徐々に低下する速度を特定の内因性因子が設定するはずであると提案します。オートファジー活性の調節を通じて細胞の老化速度を決定する分子時計因子はルビコンであり、最近、分岐動物分類群において成体寿命にわたってそのプロセスを徐々に抑制することが示された19。

成人後期になると多くのニューロンでオートファジーが損なわれるのはなぜでしょうか? Atg 遺伝子のランダムな不活化変異に加えて、特定の遺伝的要因が高齢者のオートファジーを負に制御する可能性があります。我々は、PI3K/Vps34に拮抗することでオートファジーを妨害する保存されたミオチューブラリン関連脂質ホスファターゼをコードするEDTP遺伝子(図2A)23,25,34も、成人期に脳内で発現量が増加していることを実証した(図4A、 B)。 EDTP タンパク質も、この器官では年齢とともにますます蓄積するようです (図 4C-C')。ニューロンにおけるそのダウンレギュレーションは、オートファジーを大幅に誘発し、運動を改善し、寿命を延長しました（図5、図S3C-D'および図S4A'）。これらの結果と一致して、ヒトMTMR14は、若い患者と比較して高齢患者のヒト皮質ニューロンにおいてより高いレベルで蓄積することも判明した（図6B-C'、図S7A-B'）。さらに、MTMR14発現は年齢とともに増加しました（図6D、図S7C、D）。イヌにおいても、MTMR14は同様に、若者と比較して高齢者の脳の前頭前野において高いレベルで発現していた（図6E）。ルビコンと同様に、EDTP と MTMR14 は一緒になって、寿命の間にオートファジーを徐々に抑制します 19。 EDTP と MTMR14 は両方とも、オートファジープロセスの初期段階と後期段階の両方でこの機能を実行します (図 1B–C'')22。一方、ルビコンは後者のみでこの機能を実行します 19。これらのデータに基づいて、EDTP/MTMR14タンパク質によって調節されるクラスIII PI3K複合体は、年齢依存的にオートファジーを抑制できる主要な分子時計として進化した可能性があると結論付けることができる。したがって、複合体の活性は老化の兆候として機能します。

老化は、時間の経過に伴う生物の体力と一般的な生理機能の自然な低下であり、修復されていない細胞損傷の進行性の蓄積によって引き起こされます1、2、3、4、44。このプロセスは、生殖後の成体を集団から排除することに貢献し、それによって資源が限られた条件下での種内競争を減少させます。したがって、老化を促進する遺伝的要因の出現は、個体の命を犠牲にして種の長期生存を強化する可能性があります。生物の老化の一環として、神経機能の崩壊が徐々に進行し、個体の生存能力が徐々に制限されます。この研究で、我々は、成人期に脳がますます加速する速度で劣化するという、新しい調節機構を発見しました。我々は、オートファジープロセスの2つの保存された負の制御因子であるショウジョウバエEDTPとヒトMTMR14が、成人期を通して脳ニューロンに徐々に蓄積することを実証した（図4、6B〜C'）。したがって、これらのオルソロガスタンパク質は、特定の成人段階でニューロン内の臨界蓄積レベルを通過した後、時間の経過とともにオートファジーをますます下方制御することにより、脳の老化を促進し、寿命を制限する内因性老化促進因子として機能します（図6F）。オートファジー能力の低下により、ニューロンは徐々に感受性を増し、細胞損傷を蓄積し、その結果、成体寿命の間に死に至ります。

保存されたMTMR脂質ホスファターゼEDTPおよびMTMR14は、寿命の間にオートファジー活性を徐々に低下させる内因性因子として作用するため、新しい種類の内因性老化促進制御因子となる。老化制御における EDTP と MTMR14 の機能は、Rubicon19 の機能と類似しているようです。要約すると、この研究で提示されたデータは、脳の老化を促進する新たなメカニズムを明らかにしています。私たちは、加齢に伴うニューロンの消滅に対する徐々に高まる感受性は遺伝的に決定されていると示唆しています。脳の老化は、少なくとも部分的には制御されたプロセスであり、神経変性状態になるのは単に個人が生き続ける時間の問題です。

以前に、我々は、哺乳類のMTMR14とMTMR6-8のハエオルソログであるEDTPとMtmr6の両方が、それぞれオートファジー制御において機能することを発見した21,45,46。これらのタンパク質は、幼虫 (L3F 期) の脂肪体において状態に依存して調節的役割を果たします。 EDTP は基礎オートファジーを阻害しますが、ストレス誘発オートファジーには影響を与えません。一方、Mtmr6 は基礎オートファジーを促進しますが、さまざまなストレス条件下でプロセスを阻害します。哺乳類では、MTMR14 と MTMR8 はそれぞれ PI3P を PI に変換しますが、MTMR6 は PI(3,5)P2 の生成をブロックします 38。飢餓条件下でも栄養豊富な条件下でも、MTMR14 はオートファジーを阻害しますが、MTMR6 は飢餓誘発オートファジーにのみ影響します 22。したがって、MTMR14 と MTMR6 は異なるモデル系で異なる役割を果たします。将来的には、成人の神経系と寿命の決定におけるこれらのタンパク質の機能的関係を研究する価値があります。

ハエは、通常のハエのコーンミール栄養を与えて 25 °C または 29 °C で維持されました。株は、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター (BDSC) および京都ショウジョウバエ遺伝資源センター (DGRC) から注文されたか、別の研究者から提供されたか、または当社が以前に作成および記載したものです。

免疫組織化学および蛍光顕微鏡検査には、w[1118] (BDSC: 5905) および UAS-GFP-2xFYVE (II) (BDSC: 42712) 動物 (Appl-Gal4 と交配) をそれぞれ使用しました。内因性 GFP-Atg8a の発現については参考文献 31 に記載されています。

ウェスタンブロット分析では、w[1118]をコントロールとして使用しました。 EDTP 過剰発現には、Appl-Gal4 (BDSC: 32040) の制御下で EDTP[GSV6] (DGRC: 202239) を使用しました。 EDTP[MI008496] (BDSC: 44782) を低型対立遺伝子として使用しました。

w[1118]の動物たち。 3xmCherry-Atg8 は w[1118]; + ; UAS-GFP-Lamp1 遺伝子型は、Gábor Juhász (Eötvös Loránd University Budapest、Hungary) によって提供されました。寿命アッセイの場合、y[1] v[1]、Appl-Gal4。 EDTP TRiP /tubGal80[ts] および y[1] sc[*]v[1]、Appl-Gal4; eGFP TRiP /tubGal80[ts] (コントロール) 動物は、Appl-Gal4、tubGal80[ts];TM2/TM6B (BDSC: 7108)、eGFPTRIP (V22) (BDSC: 41550) および EDTP TRIP (V22) (BDSC) を交配することによって作成されました。 :41633)の動物たち。別の寿命アッセイおよび登山アッセイの場合、w[1118]/+ を持つ動物。 +; pleGal4/+ および w[*]/+; +; UAS-EDTP-RNAi/pleGal4 遺伝子型は、pleGal4 (BDSC: 8848)、w[1118]、eGFPTRiP (V22)、EDTP TRiP (V22) および w[*] を交配することによって作成されました。 UAS-EDTP-RNAi (III) 動物は、Tamás Lukácsovich (カリフォルニア大学発生細胞生物学部、米国カリフォルニア州アーバイン) から寄贈され、Manzéger et al. 47 に記載されています。ハエを 29 °C で保管し、死んだ動物を毎日数えました。

寿命測定、クライミングアッセイおよびタンパク質ユビキチン化テストでは、2 つの異なる RNAi 構築物を使用して EDTP 発現を下方制御しました。 BDSC：41633（EDTP-RNAi（V22））株には、より短い標的配列：CAG TAG TGT AAT AGT AAT CAA（図S2B）が含まれていますが、他の構築物（EDTP-RNAdsRNA）には、より長いが異なる標的配列が含まれています（図S2B）。 S2B): ctc ギャグ GGT ACC GGG AAA TGG ACT CTT CGG GCA AGT TGG GGG AGT GGG AGG TGG AGG CTC CTC GGG AAC AAC CGC CAC TGC CAC GCC TCT GAA CAG CAG TGC AGG AAG CAC CGG AAG TGA GGG TGT GGG CAT CCA AGC CTT TGT GAC CTT TGC CAA TCC CCT GCA GAC GCA ACA ACA GCA TCC GCT CCA GCA ACA ATA TCC CTC GCA GAT GCA TCC CCT CCA CGC GCA ATA TCC CTC CCA GCA GCC ACA TCC ACT CCA GCA GCA GCA GCA GCC ATC GCA ACA GCA ACC ACA AAA TAC GAT ATA CGA GGA TCA GTA TGA TAT CCA GCG AAT GCG GGA ATT GGT AAC GAT GGC CAA ATA TGC GAG ATG CCG TCA AAG ATT CGC CGT GCC TGT GAT TAT GTA TCG CGG AAA GTA CAT ATG CCG CTC TGC CAC GCT ATC CGT CAT GCC AGA AAC CTA CGG CCG AAA AGT GGT GGA CTA TGC CTA CGA CTG CCT GAG TGG CGG CAA TTA CAC CGC GCC AAA CGG AGA AGA GAA CGA TGC TGA CTC CAC GGA CGA GTC GCT GAT CAC CCA CAT GCA CGA CCA GGC GCA GTC GCA GTT CAG CTA CGA CGA AGT CAT CAA GAG TGA CAT CCA GCT GCT GCA TAC GCT CAA TGT CTC AAC CAT TGT GGA CCT CAT GGT CGA AAA CCG CAA AAT CAA ATA CTT CAT GGC aga tct.

EDTP 発現を研究するには、y[1] w[*]; Mi{Trojan-GAL4.0}EDTP[MI08496-TG4.0]/ P{y[+ t7.7] w[+ mC] = 10XUAS-IVS-myr::GFP}su(Hw)attP5 および y[1 ] w[*]; Mi{Trojan-GAL4.0}EDTP[MI08496-TG4.0]/ P{w[+ mC] = UAS-GFP.nls}14 匹の動物は、EDTP TrojanGal4 (BDSC: 66899)、UAS-myrGFP (BDSC) を交配することによって作成されました。 : 32199) および UAS-GFPnls (BDSC: 4775) 株。 mCherry-Atg8a 標識オートファジー構造の測定には、Gábor Juhász (解剖学、細胞および発生生物学部、エトヴェシュロラン大学、ブダペスト、ハンガリー) のご厚意により提供され、参考文献 48 に記載されている UAS-mCherry-Atg8a 導入遺伝子を適用しました。

Atg8a レベルを測定するために、GFP-Atg8a (p-Atg8a-eGFP-Atg8a) レポーター構築物を使用しました 31。サンプルを 4% ホルムアルデヒド (PBS に溶解) で前処理し、PBS で 3 回 (10 分間) 洗浄しました。核をグリセロール:PBS (4:1) カバー溶液中の 50 μg Hoechst で染色しました。測定中、すべてのサンプルに対して同じ露光時間と倍率を使用しました。

固定および免疫組織化学は参考文献46に従って実施した。以下の抗体を使用しました：抗 Ref(2)P 1:200、ウサギ - エトヴェシュロラン大学、ブダペスト、ハンガリーの解剖学、細胞および発生生物学部門の Gábor Juhász からの贈り物 49、および抗 Atg5 (1:500) 、ウサギ、Sigma Aldrich、AV54267）、抗ユビキチン（1:500、マウス、Merck、ST1200）。次の二次抗体を使用しました:抗ウサギ Alexa Fluor 488 (1:500、Life Technologies、A11008)、抗マウス Alexa Fluor 488 (1:500、Life Technologies、A11001)。核をヘキスト色素(0.1 mg/ml、Molecular Probes、33342)で染色した。

蛍光画像は、ApoTome を備えた Zeiss Axioimager Z1 正立顕微鏡 (対物レンズ Plan-NeoFluar 10 × 0.3 NA、Plan-NeoFluar 40 × 0.75 NA、および Plan-Apochromat 63 × 1.4 NA 付き)、および Nikon C2 共焦点顕微鏡 (対物レンズ付き) で撮影しました。目標 60 × 石油計画 APO VC NA = 1.45)。 AxioVision 4.82 および Jmage J 1.52c ソフトウェアを使用して、得られたデータを検査および評価しました。 mCherry-Atg8a 粒子と GFP-Lamp1 粒子の共局在を評価するために、Image J 1.52c によってピアソン係数を計算しました。

ウェスタンブロットサンプルは 10 頭の雌の頭部から調製され、32 μl の Fly Lysis バッファー + 32 μl の 2 × Laemmli バッファーで処理されました。 15 µl のサンプルを 4 ～ 20% Mini-PROTEAN® TGX™ Gel 上で泳動し、ニトロセルロースメンブレン (Kisker Biotech、40520100) にブロットしました。 TBST に溶解した 3% 粉乳 (BioRad 170-6404 /Blotting-Grade Blocker/) でブロッキングした後、膜を特異的抗体 [抗チューブリン (1:1000、マウス、Sigma T6199)、抗 Ref(2)] でプローブしました。 P (1:2000、ウサギ 48)、抗 Atg8a (1:2500、ウサギ 50)、抗 EDTP、1:1000、rat22、抗マウス IgG アルカリホスファターゼ (1:1000、Sigma、A8438)、および抗ウサギIgG アルカリホスファターゼ (1:1000、Sigma、A3687)、抗ラット IgG アルカリホスファターゼ (1:1000、Sigma、A5153)、および NBT-BCIP ソリューション (Sigma、72091) によって開発されました。各ウェスタンブロット分析は、独立した生体サンプルを使用して少なくとも 3 回繰り返されました。

Direct-zol™ RNA MiniPrep キット (Zymo Research、R2050) プロトコルに従って、生後 1、10、20、30、40、50、および 60 日の成虫の頭部から全 mRNA を単離し、cDNA を生成しました。 RevertAid RT 逆転写キット (Thermo Scientific、K1691) による。定量的リアルタイム PCR 反応は、FastStat Essential DNS Green Master キット (Roche、06924204011) を備えた Roche LightCycle 96 装置 (Roche Molecular Systems) で実行されました。新たに分離されたサンプルを使用して定量測定が 3 回繰り返され、各 qPCR 実験には 3 回の技術的反復が含まれていました。 GAPDH mRNA レベルを内部対照として使用しました。フォワード (F) およびリバース (R) プライマーは次のとおりです: EDTP F: 5'-AAA AAG CTC CGG GAA AAG G-3' および R: 5'-AAT TCC GAT CTT CGA CAT GGC-3'、GAPDH F: 5'-TAC TTC ATG GCC GTT TCC TC-3' および R: 5'-AGA TCC CAA TCC CGG TAC TC-3'。

標準プロトコールに従って、さまざまな成体段階のショウジョウバエからゲノム DNA を単離しました (Thermo Scientific GeneJET ゲノム DNA 精製キット #K0721 および #K0722)。サンプルを DpnI で 37 °C で 20 分間消化し、次に酵素を 80 °C で 20 分間不活化してから、Yao et al.42 によって以前に記載されているように PCR 実験を実行しました。フォワードプライマー、リバースプライマー、PCR条件は以下の通り。ショウジョウバエの場合、コントロール: 5'-TGA GGA ACA TCA TTC TTG GCT C-3' および 5'-CTA CGG GGA GCT GAT GTA CT-3'。 6mA EDTP: 5'-ACC GTT AGG TCA GAT CTA TCC AG-3' および 5'-CTA CGG GGA GCT GAT GTA CT-3'。 PCR: 95 °C で 30 秒、次に 95 °C で 10 秒、58.8 °C で 30 秒を 30/50 (コントロール/サンプル) サイクルで繰り返します。

pleGal4ドライバーの制御下で導入遺伝子を発現する20匹の成虫ハエ(29℃で飼育)を麻酔し、垂直ガラスカラム(長さ25cm、直径1.5cm)に置いた。 CO2 曝露からの 1 時間の回復期間後、ハエをカラムの底に 5 回軽く叩きました。 20秒以内に高さ21.8cmのラインに到達したハエの数を数えた。各実験では、2 回の並行測定を 3 回実行しました。スコアは、テストされた総数に対する頂点に到達したハエの平均数を表します。結果は平均値 ± SD として表示されます。

寿命の測定には、同数の男性と女性が使用されました。動物を２日ごとに、新鮮な栄養分が入ったバイアルに移した。死んだ動物の数を毎日数えた。測定は 5 つの平行で実行されました。テストは 25 °C と 29 °C で実施されました。

クライミングアッセイ、寿命測定 (平均寿命)、および蛍光顕微鏡検査の統計分析の場合、結果は R Studio (バージョン 3.4.3) を使用して決定されました。サンプルの分布 (正常かどうか) は、Lilliefors 検定で検定されました。正常であれば、F 検定を実行して分散を比較しました。分散が等しい場合は 2 サンプルの t 検定が使用され、そうでない場合は分散が等しくない場合は t 検定が適用されました。非正規分布の場合は、Mann-Whitney U 検定を実行しました。寿命曲線統計には、SPSS17.0 プログラムで計算されたログランク (マンテル-コックス) 法が使用されました。

オートファジーエンドサイトーシス経路およびオートファジー障害におけるユビキチン化タンパク質は、それぞれ抗ミオチューブラリン関連ホスファターゼMTMR14抗体の免疫組織化学的局在化によって観察されました。脱パラフィンおよび再水和後、抗原を回収するために、切片を電子レンジ（900 ワットに設定）で 0.01 M クエン酸緩衝液（pH 6.0）中で 2 分間煮沸しました。 3% H2O2 を含む 0.1 M TBS 中で内因性ペルオキシダーゼを 37 °C で 10 分間ブロックした後、切片を 0.1 M TBS (pH 7.4) 中で室温で 3 ～ 5 分間洗浄しました。次に組織切片を透過処理し、ブロッキング溶液 (5% 正常ヤギ血清、1% BSA、0.05% Triton X-100 を含む 0.1 M TBS) 中で 37 °C で 30 分間、抗体のバックグラウンド結合を減少させました。マウス抗NeuN一次抗体（最終希釈1:500、Chemicon、マサチューセッツ州ビレリカ）、ウサギポリクローナル抗MTMR14一次抗体（最終希釈1:100、ab102575、Abcam、Cambridge）のいずれかを含む上記溶液で切片を覆った。、英国）4℃で一晩。一次抗体とのインキュベーション後、切片を 0.1 M TBS (pH 7.4) 中で室温で 4 × 5 分間洗浄しました。ネガティブコントロール実験は、適切な一次抗体を省略した場合に実行されました。次いで、切片をブロッキング溶液（Triton X-100は省略した）中でビオチン化抗ウサギまたは抗マウスIgG二次抗体（最終希釈1：200、Amersham Biosciences、Little Chalfont、Buckinghamshire、England）で5時間処理した。 RTで。数回洗浄した後（4×5分）、ブロッキング溶液（Triton X-100を含まない）中のビオチン化ストレプトアビジンペルオキシダーゼ三次抗体（最終希釈1：200、Amersham）を4℃で一晩切片に適用しました。切片を再び0.1 M TBS（pH 7.4）で室温で4×5分間洗浄し、製造元のプロトコールに従ってSigma Fast DAB Tablet（Sigma、セントルイス、ミズーリ州、米国）を使用してペルオキシダーゼ酵素組織化学のために処理しました。切片を 0.1 M TBS (pH 7.4) で室温で 5 分間 3 回洗浄し、蒸留水で 1 分間リンスし、一連のエタノール溶液で脱水し、DPX 封入剤 (Fluka、30 Buchs、スイス) で覆い、カバースリップをかけました。。

NeuN について免疫染色された 4 人の非認知症被験者の側頭皮質切片のデジタル画像 (年齢、性別、死後遅延およびブラーク段階については表 S4 を参照) を、ライカ DMLB 光学顕微鏡 (Leica Microskopie und Systeme GmbH; Wetzlar,ドイツ）Qimage MicroPublisher 3.3 RTV デジタルカメラ（カナダ、ブリティッシュコロンビア州サリー）を使用。 NeuN 陽性細胞 (図示せず) は、コンピュータプログラム ImageJ (バージョン 1.47; 米国国立衛生研究所の W. Rasband によって開発され、インターネット http://rsb.info.nih から入手可能) を使用して計数されました。 gov/ij) を以前に公開しました (詳細については、参考文献 35、51 を参照してください。MTMR14 免疫反応性は、ImageJ 画像処理ソフトウェアを使用して、リポフスチンを含まない細胞質で定量化されました。非認知症サンプルからの合計 134 個の細胞が分析されました。 2 人の独立した研究者によって測定され、密度値が平均されました。

タンパク質分布は、フルオロフォレチラミドシグナル増幅法を使用した免疫蛍光技術を使用して測定されました（Perkin Elmer、Waltham、MA、USA）。 BOND-RX 自動染色装置 (Leica Biosystems、Wetzlar、ドイツ) を使用して、染色用のスライドを準備しました。切片を「ベーキング」し（60 °C で 30 分間）、Bond Dewax Solution（Leica Biosystems、72 °C）を使用して脱蝋し、熱誘発エピトープ回復ステップ（EDTA ベースの溶液、pH 9.0、60 °C で 20 分間）を実行しました。 100℃）。

この「前処理」の後、スライドをリン酸緩衝食塩水 (PBS) で手動で洗浄し、0.03% H2O2 中で 30 分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼをブロックし、再度洗浄しました。ヒト SQSTM1 に対して産生されたウサギ一次抗体 (HPA003196、Atlas Antibodies、ストックホルム、スウェーデン) を一次抗体バッファー (0.3% TX-100、0.1% NaN3、PBS) で 1:10 に希釈し、加湿チャンバー内で一晩インキュベートするためにスライドに添加しました。 4℃で。翌日、スライドをトリス緩衝生理食塩水（TBS、pH 7.4）-Tween 20で洗浄し、トリス-NaClブロッキングバッファー（TNB）（0.1 mol/L Tris-HCl、pH 7.5、0.15 mol/L NaCl）でブロックしました。、0.5% ブロッキング試薬、Perkin Elmer) を 30 分間使用します。次に、TNB で 1:200 に希釈したブタ抗ウサギ HRP 結合二次抗体 (DAKO) をスライドに 30 分間適用し、その後 TBS-Tween 20 で洗浄しました。チラミドシグナルについては、増幅スライドをフルオレセイン結合チラミドとインキュベートしました。増幅試薬（Perkin Elmer）中で室温で 15 分間希釈（1:100）しました。

組織内のリポフスチン自己蛍光を消すために、スライドを親油性スーダンブラック B 溶液（70% エタノール中 1% w/v、Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国）で 5 分間対比染色しました。次に、スライドを 70% エタノールに浸し、その後 PBS で洗浄し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) 対比染色 (DAPI を含む ProLong Gold Antifade Mountant、ThermoFisher Scientific、Waltham、米国マサチューセッツ州）。特に明記しない限り、すべてのステップは室温で実行されました。

画像は、自動 VSlide スライドスキャンシステム (Metasystems、Altlussheim、ドイツ) で取得されました。スライド上の組織片全体を 20 × 対物レンズ (NA = 0.45、解像度 3.6 ピクセル/μm) で画像化しました。各視野を 1 μm 間隔の 3 つの Z レベルでキャプチャし、拡張焦点画像を作成しました。取得した視野画像をつなぎ合わせて、顕微鏡解像度の完全な概要を作成しました。蛍光団結合二次抗体の発光スペクトルは次のとおりです: Hoechst (420 ～ 485 nm)、Cy2 (490 ～ 530 nm)、Cy3 (550 ～ 570 nm)、Cy3.5 (580 ～ 595 nm)、および Cy5 (650 ～ 670 nm)。

Direct-zol™ RNA MiniPrep キット (Zymo Research、R2050) プロトコールに従って、総ヒト mRNA サンプルを側頭皮質組織から単離し、次に RevertAid RT 逆転写キット (Thermo Scientific、K1691) によって cDNA を生成しました。定量的リアルタイム PCR 反応には、FastStat Essential DNS Green Master キット (Roche、06924204011) を備えた Roche LightCycle 96 装置 (Roche Molecular Systems) を使用しました。 GAPDHを内部対照として使用した。以下のフォワードおよびリバースプライマーを使用しました: GAPDH: 5'-TCG GAG TCA ACG ATT TGG T-3' および 5'-TTC CCG TTC TCA GCC TTG AC-3'、MTMR14: 5'-GTA ACG GGC TGT GGC AGT AT-3' および 5'-TTC CCG TTC TCA GCC TTG AC-3'。

アブカムのウェスタンブロット用の標準サンプル調製プロトコールに従って、側頭皮質組織からタンパク質を単離しました。電動ホモジナイザーを使用して、各サンプルあたり 15 mg の組織を 600 μl の溶解バッファー (RIPA バッファー、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む) 中でホモジナイズしました。 20 µl のサンプルを 4 ～ 20% Mini-PROTEAN® TGX™ Gel 上で泳動し、ニトロセルロースメンブレン (Kisker Biotech、40520100) にブロットしました。 TBST に溶解した 3% 粉乳 (BioRad 170-6404 /Blotting-Grade Blocker/) でブロッキングした後、膜を特異的抗体 [抗 GAPDH (1:2000、ウサギ、Sigma G9545)、抗 MTMR14 (1: 500、ウサギ、Abcam ab102575）、抗ウサギ IgG アルカリホスファターゼ（1:1000、Sigma、A3687）、NBT-BCIP ソリューション（Sigma、72091）によって開発されました。

対照ヒト側頭皮質組織は男性5名、女性1名（SKO20：27歳、SKO7：55歳、SKO19：61歳、SKO11：77歳、SKO16：72歳）から採取した。歳、SKO18: 85 歳）被験者は脳疾患とは無関係の原因で死亡し、神経疾患の病歴もありませんでした。対照被験者は、ハンガリーのタタバーニャにある聖ボルバラ病院病理学部で解剖のために処理された。組織はヘルシンキ宣言に準拠した方法で入手および使用されました。すべての手順は、ハンガリー法 (ETT TUKEB 15032/2019/EKU) に従って、保健科学評議会の科学および研究倫理の地域および機関委員会によって承認されました。

死後2～4、5時間後に脳サンプルを採取し、内頚動脈と椎骨動脈の両方にカニューレを挿入し、最初に5mlのヘパリンを含む生理食塩水(30分で1.5l)で灌流し、続いて4%を含む固定液で灌流した。パラホルムアルデヒド、0.05% グルタルアルデヒドおよび 0.2% ピクリン酸を含む 0.1 M PB、pH 7.4 (1.5 ～ 2 時間で 4 ～ 5 l)。側頭皮質は灌流後に除去され、同じ固定液中で一晩後固定されましたが、グルタルアルデヒドは使用されませんでした 52。続いて、免疫組織化学のために、Leica VTS-1000 Vibratome (Leica Microsystems、Wetzlar、Germany) を使用してブロックから厚さ 60 μm の冠状切片を調製しました。切片を PB で洗浄し、30% スクロースに 1 ～ 2 日間浸漬し、液体窒素で 3 回凍結融解しました。免疫染色のために切片を次のように処理しました。PBで5回徹底的に洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼ活性をTRIS緩衝生理食塩水（TBS、pH 7.4）中の1％H2O2で10分間ブロックしました。すべての洗浄（各抗血清の間に 3 × 10 分）および抗血清の希釈には TBS を使用しました。共焦点顕微鏡検査では、一次抗体のインキュベーションを同時に行いました (抗 MTMR14、ウサギ、1:500; ABCAM、#ab102575)、抗 NeuN、マウス、1:2000; 抗 NeuN、マウス、1:2000; メルク社、#Ab377)。インキュベーション後、蛍光団を含む二次抗体を 3 時間適用し (DAM Alexa488 1:500; Thermofisher、#A-2107、DAR Alexa594 1:500; Thermofisher、#A-2102)、サンプルを DAPI 蛍光団 (1: 10,000、Sigma-Aldrich、#D9564）を 2 時間。自己蛍光を低減するために、サンプルを CuSO4 溶液で 40 分間インキュベートするか、サンプルを 70% エタノール中の AER (Autofluorescent Eliminator Reagent; Merck、#2160) で 5 分間処理しました。その後、サンプルを Aqua-Poly/Mount (Polysciences、#18606-20) にマウントしました。蛍光強度の低下を引き起こす追加の化学物質との相互作用を避けるために、AER を使用せずに定量測定を実行しました。サンプルは、60 倍の油対物レンズを備えた Nikon C2 共焦点蛍光顕微鏡を使用して分析されました。ＲＯＩ（関心領域）領域は、側頭皮質（ブロードマン領域３８）セクションの皮質層３の全幅から定義された。 NeunN 標識細胞は、核周囲の最大範囲で撮影されました。この方法では、およそ。各皮質サンプルの 3D 層から 30 個の細胞を撮影しました。 NeuNm/MTMR14r/DAPI 三重蛍光共焦点画像を ImageJ 1.50b プログラムによって分析しました。測定中、3 つのチャネル (緑: 488 nm、赤: 594 nm、青: DAPI 470 nm) が個別に視覚化されました。核または自己蛍光リポフスチンのない細胞質領域は、NeuN (緑色) および DAPI (青色) チャンネルを使用して決定されました。これらのセルでは、2 ～ 4 µm2 の ROI 領域が 1 つまたは 2 つ指定されました。強度は、MTMR14 免疫標識に対応する赤色チャネルの ROI 領域で測定されました。イメージングパラメータは均一でしたが、サンプルの個体差により絶対強度値は比較できないため、個々の細胞ごとに相対強度単位（IU）を決定しました。参照強度として、ニューロンに隣接するグリア細胞の相対強度（上記のように測定）を使用した。相対強度は次の式に基づいて計算されました: IU = (AI-RI)/(MI-RI) × 100、ここで AI はニューロンの細胞質で測定された絶対強度、RI は参照強度、MI は最高画像で見つかった強度。識別可能なグリア細胞のない画像については、被験者の画像の RI 値の平均を計算に使用しました。統計には、Microsoft Excell のダイアグラム Statistica 13.4 プログラムを使用しました。 6 人の被験者は、27、55、および 61 歳の被験者を含む「若者」と、72、77、および 85 歳の被験者を含む「高齢者」の 2 つのグループに分けられました。得られた IU 値の正規性は、コルモゴロフ・スミルノフ検定によってチェックされました。 P > 0.2 値に基づいて、データは正規分布しているため、2 つのグループのプールされた強度単位データを T 検定によって比較しました。

メーカーの指示に従って、TRIzol (ThermoFisher Scientific、#15596018) を使用して、RNAlater (Thermo Fisher Scientific、#AM7021) で凍結保存されたイヌ前頭皮質サンプルから全 RNA を単離しました。組織片を TRIzol に浸漬する前に、各組織片を新しいチューブ内の 1 ml の滅菌 PBS ですすぎ、500 g で 5 分間遠心分離しました。 PBSを除去した後、TRIzolをサンプルに添加しました。組織片は、Ultra-Turrax ホモジナイザー (Ika) により TRIzol 中で均質化されました。均質化後、RNA を単離しました。分離株の品質はアガロースゲル電気泳動によってチェックされ、濃度はNanoDropデバイス（ThermoFisher Scientific）によって測定されました。単離された RNA サンプルは、cDNA 合成前は -20 °C で保存され、長期保存の場合は -80 °C で保存されました。

Maxima RevertAid cDNA 合成キット (Thermo Fisher Scientific、#K1672) を使用して、1000 ng の全 RNA を cDNA に逆転写しました。逆転写は、ランダムヘキサマープライマーを使用して実行されました。次に、cDNA サンプルをヌクレアーゼフリーの水で 10 倍に希釈し、-20 °C または -80 °C で保存しました。定量的リアルタイム PCR 反応は、市販の TaqMan アッセイおよび TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific、#4369514) を使用して、Roche LightCycle 96 装置 (Roche Molecular Systems) で実行されました。 MTMR14 および GAPDH (内部対照) のイヌオルソログは、それぞれ Cf02682018_g1 および Cf04419463_gH です。反応は96ウェルプレートで3回繰り返して実行されました。

脊椎動物被験者の実験に関する手順は、ハンガリーのブダペストにあるエトヴェシュ・ロラン大学のガイドに従って行われました。私たちは、原稿に記載されている研究が ARRIVE ガイドラインに従って実施されたことを確認します。

動物および人間の脳サンプルの取り扱いは、セゲド大学医学部および科学情報学部（ハンガリー、セゲド）の人体実験委員会、およびハンガリー科学アカデミー実験医学研究所のガイドラインに従って行われました。（ハンガリーのブダペスト）で実験が行われました。すべての被験者および/または法的保護者（原稿でのデータ使用について）からインフォームドコンセントが得られたことを確認します。

動物および人間の脳サンプルの取り扱いは、セゲド大学医学部および科学情報学部（ハンガリー、セゲド）の人体実験委員会、およびハンガリー科学アカデミー実験医学研究所のガイドラインに従って行われました。（ハンガリーのブダペスト）で実験が行われました。現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

オートファジー関連

コイルドコイルのミオシン様 BCL2 相互作用タンパク質

卵由来ホスファターゼ

Fab 1 (PIKfyve の酵母オルソログ) YOTB、Vac 1 (小胞輸送タンパク質) および EEA1

緑色蛍光タンパク質

インスリン様成長因子

微小管関連タンパク質 1A/1B 軽鎖 3B

ミオチューブラリン

ミオチューブラリン関連

ホスファチジルイノシトール

クラス III ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ

ホスファチジルイノシトール 3-リン酸

ホスファチジルイノシトール 3,5-二リン酸

ルビコン (RUN ドメインとシステインに富んだドメインを含む、Beclin 1 相互作用タンパク質)

続核体 1

ラパマイシンの標的

紫外線耐性関連遺伝子

空胞タンパク質ソーティング 34

N6-メチルアデニン

カークウッド、TBL 古い問題を体系的に考察。ネイチャー 451、644–647 (2008)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Vellai, T. オートファジー遺伝子と老化。細胞死は異なります。 16、94–102 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Vellai, T.、Takács-Vellai, K.、Sass, M. & Klionsky, DJ 老化の制御: オートファジーは長寿の根底にあるのか? トレンドセルバイオ。 19、487–494 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

Vellai, T. アミノ酸ロイシンが重要な細胞増殖制御因子 mTOR をどのように活性化するか。 Nature 596、192–194 (2021)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Lopez-Otin、C.、Blasco、MA、Partridge、L.、Serrano、M.、Kroemer、G. 老化の特徴。セル 153、1194 ～ 1217。

記事 Google Scholar

Sturm, Á.、Ivics, Z. & Vellai, T. 老化のメカニズム: ゲノム崩壊における転移因子の主な役割。細胞。モル。生命科学。 72、1839–1847 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

Sturm , Á. 、Perczel , A. 、Ivics , Z. & Vellai , T. Piwi-piRNA 経路: 不死への道。老化セル 16、906 ～ 911。

記事 CAS Google Scholar

Takács-Vellai, K.、Bayci, A. & Vellai, T. 神経細胞喪失におけるオートファジー: 死への道。 BioEssays 28、1126–1131 (2006)。

記事 Google Scholar

Vellai, T.、Tóth, ML & Kovács, AL ヤヌス顔のオートファジー: 神経変性における細胞の自己食べることの二重の役割?. オートファジー 3、461–463 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Levine, B. & Kroemer, G. 疾患の発症におけるオートファジー。セル 132、27–42 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

水島 N.、Levine, B.、Cuervo, AM、Klionsky, DJ オートファジーは、細胞の自己消化を通じて病気と闘います。 Nature 451、1069–1075 (2008)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Yang、Z. & Klionsky、DJ 生きたまま食べられる: マクロオートファジーの歴史。ナット。セルバイオル。 12、814–822 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

Rubinsztein, DC 神経変性における細胞内タンパク質分解経路の役割。 Nature 443、780–786 (2006)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Rubinsztein, DC、Mariño, G. & Kroemer, G. オートファジーと老化。セル 146、682–695 (2011)。

記事 CAS Google Scholar

Nezis、IP et al. Ref(2)P、哺乳動物 p62 のキイロショウジョウバエ相同体は、成体の脳におけるタンパク質凝集体の形成に必要です。Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ． 180、1065–1071 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Simonsen, A. et al. 神経系におけるオートファジーの基礎レベルを促進すると、成体のショウジョウバエの長寿と酸化剤耐性が向上します。オートファジー 4、176–184 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Chang、JT、Kumsta、C.、Hellman、AB、Adams、LM、Hansen、M. Caenorhabditis elegans の老化中のオートファジーの時空間制御。イーライフ 6、(2017)。

Xie, Z.、Nair, U. & Klionsky, DJ Atg8 は、オートファゴソーム形成中のファゴフォアの拡張を制御します。モル。バイオル。セル 19、3290–3298 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

中村晋ほかルビコンによるオートファジー活性の抑制は老化の兆候です。ナット。共通。 10、1–11 (2019)。

記事 Google Scholar

Volinia, S. et al. 酵母 Vps34p-Vps15p タンパク質選別システムに関連するヒトホスファチジルイノールシトール 3-キナーゼ複合体。 EMBO J. 14、3339–3348 (1995)。

記事 CAS Google Scholar

トッシュ、V.ら。核中心性ミオパチーにおける不活化変異体を有する新規 PtdIns3P および PtdIns(3,5)P2 ホスファターゼ。ハム。モル。ジュネット。 15、3098–3106 (2006)。

記事 CAS Google Scholar

Vergne, I. et al. ホスホイノシチド 3-ホスファターゼジャンピーによるオートファジー開始の制御。 EMBO J. 28、2244–2258 (2009)。

記事 CAS Google Scholar

パップ、D.ら。 AUTEN-67 は、強力な老化防止効果と神経保護効果を持つオートファジー強化薬候補です。オートファジー 12、273–286 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Erdélyi、P. et al. Caenorhabditis elegansにおけるオートファジーとアポトーシスの発生的役割と転写制御の共有。 J. Cell Sci. 124、1510–1518 (2011)。

記事 Google Scholar

Manzéger, A. et al. オートファジー制御における2つのショウジョウバエMtmr脂質ホスファターゼの条件依存的な機能変化。オートファジー https://doi.org/10.1080/15548627.2021.1899681 (2021)。

記事 Google Scholar

ペトラリア、RS et al. ソニックヘッジホッグは、海馬ニューロンのオートファジーを促進します。バイオル。オープン 2、499–504 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

クリオンスキー、DJ 他オートファジーをモニタリングするためのアッセイの使用と解釈に関するガイドライン (第 3 版)。オートファジー 12、1–222 (2016)。

記事 Google Scholar

Walczak, M. & Martens, S. オートファゴソーム形成中の Atg12-Atg5-Atg16 複合体の役割を詳しく分析。オートファジー 9、424–425 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

ギルーリー、DJ 他酵母および哺乳動物細胞におけるホスファチジルイノシトール 3-リン酸の局在。 EMBO J. 19、4577–4588 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

水島直也ほか Apg5欠損マウス胚性幹細胞を用いたオートファゴソーム形成の解剖。Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ． 152、657–668 (2001)。

記事 CAS Google Scholar

Billes, V. et al. 発生的に調節されたオートファジーは、ショウジョウバエの目の形成に必要です。オートファジー 14、1499–1519 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

ビョルコイ、G. 他 p62/SQSTM1 は、オートファジーによって分解されるタンパク質凝集体を形成し、ハンチンチン誘発細胞死に対して保護効果をもたらします。Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ． 171、603–614 (2005)。

記事 Google Scholar

シグモンド、T.ら。第 30 章 Caenorhabditis elegans のオートファジー。方法酵素mol。 451、521–540 (2008)。

記事 CAS Google Scholar

Kovács、T. et al. 小分子AUTEN-99（オートファジーエンハンサー-99）は、神経変性症状の進行を防ぎます。科学。議員 7、42014 (2017)。

記事 ADS Google Scholar

Billes, V. et al. AUTEN-67 (オートファジーエンハンサー-67) は、ハンチントン病のショウジョウバエモデルにおいて神経変性症状の進行を阻止します。 J.ハンティントンズ。ディス。 5、133–147 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Lőrincz, P.、Mauvezin, C.、Juhász, G. ショウジョウバエのオートファジーの探索。セル 6、22 (2017)。

記事 Google Scholar

水島 N. & 吉森 T. LC3 イムノブロッティングの解釈方法。オートファジー 3、542–545 (2007)。

記事 CAS Google Scholar

Zou、J.ら。オートファジーとプログラム細胞死の制御におけるミオチューブラリン関連ホスファターゼの役割。上級バイオル。レギュラー。 52、282 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

ジン、N.ら TORC1を介した栄養素の感知におけるPI(3,5)P2の役割。モル。バイオル。セル 25、1171 (2014)。

記事 Google Scholar

チェン、Z.ら。 TORC1 は、シグナル伝達エンドソームおよび液胞における Fab1 脂質キナーゼの機能を決定します。カー。バイオル。 31、297-309.e8 (2021)。

記事 Google Scholar

Seroude, L.、Brummel, T.、Kapahi, P. & Benzer, S. キイロショウジョウバエにおける老化中の遺伝子発現の時空間分析。老化セル 1、47–56 (2002)。

記事 CAS Google Scholar

ヤオ、B.ら。 DNA N6-メチルアデニンは、環境ストレス後のマウスの脳内で動的に調節されます。ナット。共通。 8、1122 (2017)。

記事 ADS Google Scholar

トート、ML 他。 Caenorhabditis elegans では、長寿経路がオートファジー遺伝子に集中して寿命を制御しています。オートファジー 4、330–338 (2008)。

記事 Google Scholar

Vellai, T. & Takács-Vellai, K. 長寿経路によるタンパク質代謝回転の制御。上級経験値医学。バイオル。 694、69–80 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

アレン、EA 他。保存されたミオチューブラリン関連ホスファターゼは、オートファジーの流れを維持することによってオートファジーを制御します。Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ． 219、(2020)。

Chang, YY & Neufeld, TP TOR 媒介オートファジー制御において複数の役割を持つ Atg1/Atg13 複合体。モル。バイオル。セル 20、2004 ～ 2014 年 (2009 年)。

記事 CAS Google Scholar

Denton, D.、Nicolson, S. & Kumar, S. オートファジーによる細胞死: 事実と明らかなアーチファクト。細胞死は異なります。 19、87–95 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Pircs、K.ら。ショウジョウバエのオートファジー活性を推定するためのさまざまな p62 ベースのアッセイの利点と限界。 PLoS ONE 7、e44214 (2012)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Kis, V.、Barti, B.、Lippai, M. & Sass, M. 特殊化された皮質グリア細胞は、キイロショウジョウバエの脂肪滴を蓄積します。 PLoS One https://doi.org/10.1371/journal.pone.0131250.PDF (2015)。

記事 Google Scholar

Takáts、S. et al. オートファゴソームのシンタキシン 17 依存性のリソソーム分解は、ショウジョウバエの神経機能を維持します。Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ． 201、531–539 (2013)。

記事 Google Scholar

Szabo, M. & Gulya, K. 培養におけるミクログリア表現型の開発。神経科学 241、280–295 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

トート、K.ら。てんかん患者の海馬におけるカルレチニン含有介在ニューロンの喪失と再構成。ブレイン 133、2763–2777 (2010)。

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この研究は、テレビへの OTKA 助成金 (ハンガリー科学研究基金) K109349 および K132439、テレビ、欧州連合およびハンガリー国への MEDinPROT タンパク質科学研究相乗プログラム (ハンガリー科学アカデミー; HAS によって提供) によって支援されました。 -TVに対してEuropean Regional Development Found（VEKOP-2.3.2-16-2017-00014）、KGに対してGINOP 2.3.2-15-2016-00034、EKに対してERC starting（680040）およびBolyai（HAS）から資金提供。および国家脳研究プログラム (2017-1.2.1-NKP-2017-00002) を ZM に送信します。この研究は、MTA-ELTE 'Lendület/Momentum' Companion Animal Research Group (助成金番号 PH1404/21) および National Brain Program 3.0 (NAP2022-I-3/2022) への助成金を通じて、ハンガリー科学アカデミーの支援を受けました。 EKさんへ。 VB と TV は ELKH-ELTE Genetics Research Group (01062) によってサポートされました。この研究は、国立研究開発イノベーション局 (NKFIH-1157-8/2019-DT) の支援を受けた ELTE Institutional Excellence プログラムで完了しました。 MP は、ハンガリー脳研究プログラム (2017-1.2.1. NKP-2017-00002) の支援を受けました。ヒト組織は、ハンガリーのタタバーニャにある聖ボルバラ病院、およびハンガリーのブダペストにある HAS 実験医学研究所の人間脳研究研究所から部分的に提供されました。

Tibor Kovács と Janka Szinyákovics も同様に貢献しました。

ELTE Eötvös Loránd大学、Péter Pázmány Stnyの遺伝学部。 1/C、ブダペスト、1117、ハンガリー

ティボール・コヴァチ、ヤンカ・シンヤコヴィッチ、ヴィクトル・ビレス、ガボール・ムラーニ、ヴァージニア・B・ヴァルガ、ティボール・ヴェライ

MTA-ELTE 遺伝学研究グループ、ブダペスト、1117、ハンガリー

ヴィクトル・ビルズ & ティボール・ヴェライ

細胞生物学および分子医学科、セゲド大学、セゲド、6720、ハンガリー

アンナマリア・ビェリク、アダム・レグラディ、メリンダ・サボ、カーロリ・グリヤ

ELTE Eötvös Loránd University、ブダペスト、1117、ハンガリー動物行動学部

サンダー・サラ & エニク・クビニ

人間の脳研究所、実験医学研究所、ELKH、ブダペスト、1085、ハンガリー

セシリア・シェケレス＝パラッキー、ペテル・ゾチッチ、ゾフィア・マグロツキ

ヤーノシュ・センタゴタイ神経科学博士課程、センメルワイス大学、ブダペスト、1085、ハンガリー

セシリア・シェケレス・パラッキー & ピーター・ショシクス

聖ボルバラ病院精神科、タタバーニャ、2800、ハンガリー

ヤノス・ロケ

Science for Life Laboratory、神経科学部門、カロリンスカ研究所、171 77、ストックホルム、スウェーデン

ジュン・モルダー

Lee Kong Chian School of Medicine、Nanyang Technological University、シンガポール、636921、シンガポール

バラーズ・グリアス

人間の脳組織バンクおよび研究所、センメルワイス大学、ブダペスト、1085、ハンガリー

エヴァ・レナー & ミクロス・パルコヴィッツ

MTA-ELTE レンデュレット「モメンタム」伴侶動物研究グループ、ブダペスト、ハンガリー

エニコ・クビニ

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TK はショウジョウバエとヒトのサンプルで実験を設計して実行し、データを分析して原稿を書きました。 JS はショウジョウバエとヒトのサンプルで実験を行い、データを分析しました。 VB はショウジョウバエでさまざまな実験を実施し、GM は EDTP 発現の分析に関与しました。 VBV はショウジョウバエで実験を行いました。 AB、A.L. MSはヒトの脳サンプルにおけるp62とMTMR14の発現分析を実施した。 SSはイヌの脳サンプルにおけるMTMR14の発現解析を実施した。 CS-P。 PS は人間の脳サンプルにおける MTMR 蓄積レベルの定量化を実行しました。 JL は人間の脳組織サンプルを提供し、分析しました。 MP と ER はヒトの大脳皮質領域の顕微解剖を実施しました。 JM は人間の死後の脳サンプルにおける p62 蓄積の分析を実施しました。 EK、BG、KG、ZM、TV は実験を設計し、データを分析し、原稿を書きました。

Károly Gulya、Zsófia Maglóczky、または Tibor Vellai との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Kovács, T.、Szinyákovics, J.、Billes, V. 他保存されたMTMR脂質ホスファターゼは、加齢に伴い脳ニューロンのオートファジーをますます抑制します。 Sci Rep 12、21817 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-24843-w

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受信日: 2021 年 12 月 1 日

受理日: 2022 年 11 月 21 日

公開日: 2022 年 12 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24843-w

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