サウジアラビア東部州の処理下水中の胃腸炎病原菌の 2 つの分子検出プラットフォームの評価

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21744 (2022) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

胃腸炎の病原体、特にウイルスについて環境水サンプルをスクリーニングする能力は依然として困難です。ここでは、2018 年から 2019 年にかけてサウジアラビア王国 (SA) の冷却塔から収集した下水処理水サンプル中の腸内ウイルスの存在を調査しました。私たちの最終的な目的は、水サンプルの最適な取り扱いおよび処理条件を決定することでした。ウイルス汚染を評価するための最も感度の高い検出方法です。下水は、処理の前後に 3 つの定義されたゾーンで収集されました。サンプルは超遠心分離によって濃縮され、マルチプレックスビーズベースのアッセイシステム (Luminex テクノロジー) またはマルチプレックス PCR (QIAstat-Dx) を使用して分析されました。その後、ウイルス汚染を正確に検出するためのこれらのモダリティの効率が比較されました。合計 64 個のサンプル (16 個のコントロールとコントロールごとに 4 個の処理サンプル) が 26 個の腸内病原体について分析されました。サンプルのうち、98.7% は処理後にウイルス陰性でした。ハイブリダイゼーション法と比較してマルチプレックス PCR (QIAstat-Dx) システムの検出率は高く、その感度の高さが強調されました。サウジアラビアにおける現在の下水処理プロトコルは、ウイルス性病原体を効率的に根絶し、水系感染の可能性を最小限に抑えることができます。我々は、サウジアラビアの環境サンプルから胃腸炎関連病原体を評価するための 2 つの分子検出法の初の体系的な分析を提供します。マルチプレックス PCR (QIAstat-Dx) システムは、処理水サンプル中のウイルス病原体の検出において Luminex テクノロジーよりも優れていると結論付けています。

胃腸炎に関連する病原体は、汚染水または下水などの未処理の水源を介して糞口経路で伝染します1。エンテロウイルスはピコルナウイルス科に属し、人間や動物に感染することが知られている最小の非エンベロープウイルスです。エンテロウイルスは地上、海、下水、淡水の環境から分離される可能性があり、世界中で胃腸炎の発生を数回引き起こしています2。過去 30 年間の例としては、アジア太平洋地域での神経合併症を伴う手足口病の多数の発生や、ヨーロッパでの散発的な症例が挙げられます。欧州連合の現在の規制には、水質のパラメータとしてヒトエンテロウイルスの検出が含まれています3。一般的な廃水処理プロセスの多くは、これらのウイルスを完全に不活化することができず、レクリエーション用水がウイルス汚染に対して脆弱になっています。水中で分析される典型的なパラメータには、レジオネラニューモフィラ、肺炎桿菌、および総大腸菌群による微生物感染が含まれます。残留塩素、pH、処理下水 (TSE) 供給水の温度など、効果的な消毒性能パラメーターも頻繁に検査されます。

水サンプル中のエンテロウイルスを検出するには、ELISA や qRT-PCR ベースの増幅などのいくつかのハイスループット検出方法が使用されています 4。大きな水域に低レベルで存在するエンテロウイルスは、低感染量でヒトに感染を確立する可能性があり、これは迅速かつ高感度であることを意味します。検出技術が必要です。 qRT-PCR とそれに続く配列決定は、現在利用可能な最も特異的かつ感度の高い方法とみなされており 5、新たに発生したウイルス株の出現を記録し、ウイルスの進化を監視し、発生源を確認するために使用できます 6,7。ただし、収集されたサンプルに偽陰性の結果をもたらす可能性のある阻害成分が存在するため、これは制限される可能性があります。これが障壁となり、これらのアッセイのためのサンプル調製には依然として時間と労力がかかります。

最近、水系病原菌をよりハイスループットで検出するためのいくつかの技術が登場しました。その一例は、マルチプレックスリアルタイム PCR システムを使用して生体サンプル中の病原体の核酸を同時に検出する QIAstat-Dx アナライザーです。また、必要なすべての試薬を含むクローズドシステムを備えているため、手作業でのサンプル調製が可能になります。このシステムを使用すると、検出されたリアルタイム増幅信号を統合ソフトウェアプラットフォームを使用して自動化し、直感的なユーザーインターフェイスを介してレポートしてスループットを最大化できます。 Luminex xMAP テクノロジー (x = 分析物、MAP = 複数分析物プロファイリング) により、単一サンプル中の複数の病原体の迅速かつコスト効率の高い同時分析も可能になります。この方法には、Luminex リーダーによって認識される蛍光レポーターと結合する、対応する病原体を捕捉する特定の診断抗原で蛍光ミクロスフェアをプレコーティングすることが含まれます。このシステムは 1 つのサンプルで最大 500 のターゲットを識別でき、複数の診断研究で利用されています。

今回、我々は、サウジアラビア南部の冷却塔からの処理水サンプル中の胃腸炎関連病原体の存在を検出するために、これら 2 つの分子手法を初めて体系的に分析しました。我々は、現在の上下水処理プロトコルがウイルス病原体を効率的に根絶できることを示し、最も感度の高い検出技術としてマルチプレックス PCR (QIAstat-Dx) を推奨します。

予備処理、二次処理 (曝気および清澄剤の沈殿)、および三次処理 (砂濾過および消毒) は前述のように実行されました8。住宅地から流れる廃水（WW）は、処理施設に入る前に接続箱に集められました。 WW は輸送タンカーによって配送され、流入パイプラインと頭首工場に接続する汚泥受入施設 (SRF) で処分されました。頭首工には岩石や木材などの瓦礫を除去する前処理ステーションが設置されていました。より重い物質を除去するために、グリットチャンバーが使用されました。ヘッドワークスの出口チャンバーは、WW の流れを緊急池に迂回させ、リサイクルウェットウェルを介して処理のために戻すことができます (スプリッターボックス #1)。流入水の総流量は、出口構造の前のチャネルに配置されたパーシャル水路を使用して測定されました。流入水の水質は、サンプルの収集と溶存酸素 (DO)、pH、温度、総懸濁物質 (TSS)、オイルとグリースの評価を通じて毎日検証されました。

二次処理プロセスを補足図1に示します。ヘッドワークからのWWはスプリッターボックス#1に流れ、曝気のためにタンク1〜2に分割されました。スプリッターボックス #1 にも返送汚泥が流れ込みます。リサイクルウェットウェルは連続逆洗砂フィルターから流出しました。緊急池は補足図1に示すように流れました。表面曝気装置は、有機物の微生物学的分解を確実にするために必要なDOレベル（2.0 mg / l）を維持しました。 DO レベルはシフトごとに検証され、表面曝気装置の速度は手動で調整されました。曝気タンクの性能を検証するために、シフトサンプルが毎日収集されました。 DO、pH、温度、TSS、混合液懸濁物質 (MLSS)、混合液揮発性懸濁物質 (MLVSS)、汚泥滞留時間 (SRT)、汚泥の沈降性と色、発泡またはバルキングを測定しました。曝気タンクからの出口は、スプリッターボックス #2 の浄化装置 1 および 2 に送られました。浄化装置出口の水質は、濁度、TSS、DO、pH、および温度の評価を通じて検証されました。スラッジブランケット、トルクインジケーター、水面などの運転要因がシフトごとに記録されました。浄化装置から収集されたスラッジは、操作パラメータに基づいて定期的に廃棄されるか、スプリッターボックス #1 に戻されました。浄化装置からの汚泥廃棄物は、さらに分解して汚泥乾燥床に廃棄するために好気性消化装置に排出されました。戻された汚泥は、曝気タンク内の生物活性を維持するために、スプリッターボックス #1 にポンプで送られました。

三次処理プロセスを補足図3に示します。濾過プロセスを強化するために、浄化装置の流出水に凝集剤（ミョウバン）を連続的に注入しました。砂フィルター上での微生物の増殖を防ぐために、浄化装置の流出ラインに塩素が追加されました。砂フィルターは WW とともに連続的に作動し、湿式井戸に流れ込み、微生物汚染物質を不活化するために塩素が追加されました。塩素との接触時間は、TSE 前に 5 KM でした。 EST ポンプは、ろ過された水をウェットウェルから排水貯蔵タンクに排出しました。

三次処理下水流出物 (TTSE) は、コンプライアンスに関してサードパーティの研究所によって分析されました。 BOD、COD、TSS、総大腸菌群、腸卵、pH、濁度、温度について毎週分析を実施しました。硝酸塩については毎月のサンプル分析を実施しました。排水貯蔵タンクからの排出物は、地域の灌漑ポンプに吸引するために 30 インチのヘッダーラインに送られました。

冷却塔からの水サンプルは、2019 年 4 月 14 日から 2019 年 12 月 3 日までダーランで隔週で収集されました。ゾーンは次のように分類されました。サイト A: 未処理の下水を含む管理サイト。 Abqaiq STP 後処理 (灌漑ポンプ排出ライン); サイト B: TSE の AC プラント #2 冷却塔 (CT 供給ライン) への給水。サイト C: AC プラント #2 冷却塔循環ライン。サンプルはガラス瓶に入った 1 l の滅菌水に無菌的に収集され、リヤドのキングファイサル専門病院研究センター (KFSHRC) への輸送中、暗色の容器内で 4 °C に維持されました。サンプルは分析前に 6 時間以内に輸送されました。

9 か月間で合計 64 個のサンプルが収集されました。これらには、各場所からの 16 個の前処理源/未加工排水 (対照) サンプルと 48 個の水処理サンプルが含まれています。サンプルは到着後 12 時間以内に制御された条件下で処理されました。

前述のように、腸内ウイルスの評価には 2 段階の遠心分離法が使用されました 12。サンプルは最初に、20,450 g、4 °C、24 時間の超遠心分離によって 10 mL に濃縮されました。 2 回目の超遠心分離は、SORVALL RC 6 PLUS (アダプター: SORVALL SLA-1500 SUPER_LITE) を使用して、4 °C、182,000 g で 2 時間実行されました。サンプルは、比較スクリーニングと検出のためにマルチプレックス PCR またはハイブリダイゼーションによって並行して分析されました。残りのサンプルは 4 °C で保存しました。

サンプルはダーランで収集され、以下についてスクリーニングされました。(1) 微生物学的パラメーター:レジオネラ・ニューモフィラ、クレブシエラ・ニューモニアエおよび総大腸菌群。 (2) 消毒パラメータには、残留塩素、pH、温度、TSE 供給水と再循環水の物理的および化学的分析が含まれます。

濃縮水サンプルは、便サンプル中のウイルス、寄生虫、または細菌の核酸を検出するために設計された定性検査である QIAstat-Dx 胃腸パネル (Qiagen、米国) を使用して分析されました。これらには、ビブリオ・バルニフィカス、腸炎ビブリオ、コレラ菌、エンタメーバ・ヒストリチカ、クリプトスポリジウム属、ランブル鞭毛虫、シクロスポラ・カエタネンシス、カンピロバクター属、腸毒素原性大腸菌（ETEC）、腸内病原性大腸菌（EPEC）、腸凝集性大腸菌が含まれます。 ( EAEC）、志賀様毒素産生大腸菌（STEC [腸管出血性大腸菌]）、サルモネラ属菌、クロストリジウム・ディフィシル（tcdA/tcdB）、エルシニア・エンテロコリチカ、志賀毒素産生大腸菌（STEC）血清型O157： H7、腸管侵襲性大腸菌（EIEC）/赤癬菌、プレシオモナス・シゲロイデス、ヒトアデノウイルスF40/F41、ノロウイルスGI、ノロウイルスGII、ロタウイルスA、アストロウイルス、サポウイルスGI、GII、GIV、GV。濃縮水サンプルを消化管パネルカートリッジにロードし、QIAstat-Dx 分析装置で核酸の抽出、増幅、検出を自動的に実行しました。続いて、RT-PCR 増幅曲線を作成しました。

2 番目の分子検出方法では、xTAG 胃腸病原体パネル (GPP) に基づく多重増幅ビーズベースのハイブリダイゼーションシステムである Luminex プラットフォームを使用しました。少量のサンプルを使用して、システムは 100 個の分析物を同時に測定できます。核酸の抽出および精製は、EZ1 核酸ミニキット v2.0 (Qiagen、米国) を製造元のプロトコールに従って使用して実行しました。精製された核酸を60μlの緩衝液中に溶出した。 xTAG 胃腸病原体パネルは、QIAstat-Dx パネルと同一の細菌、ウイルス、寄生虫のリストを検出しました。

3 つの濾過ゾーンからの 16 個の対照サンプルと 48 個の試験サンプルからなる合計 64 個の水サンプルが分析されました。サンプルはダーランの現場で 2 週間ごとに収集されました。各水サンプルの物理的および化学的パラメーターが記録されました。平均値を表 1 にまとめます。

ウイルス回収率のピークは 2 回の超遠心分離後に観察されました。下水サンプル (n = 16) を陽性対照として含めました。水サンプルの濃縮により、QIAstat-Dx プラットフォームでは 59.34% の回収率が得られたのに対し、Luminex 200 プラットフォームでは 6.2% であり、その優れた分析パフォーマンスが強調されました (表 2)。

私たちは、試験サンプルと対照サンプルの両方から細菌、ウイルス、寄生虫を検出するための QIAstat-Dx および Luminex 200 プラットフォームのパフォーマンスを評価しました (図 1)。管理下水では、両方のプラットフォームでウイルス、細菌、寄生虫を 95% 以上の感度で検出できました (図 1)。検査サンプルの分析により、QIAstat-Dx は 3 つのゾーンから得られたサンプルから少なくとも 1 つの胃腸炎関連病原体を特定することができ、検出率は細菌が 4.69%、ウイルスが 14.32%、寄生虫が 5.31% でした。残りの 48 サンプルでは腸内病原体は検出されませんでした。比較すると、Luminex 200 プラットフォームは、3 つのゾーンからの 11 の水サンプルから胃腸炎関連病原体を検出し、ウイルスの検出率は 0.85%、細菌は 1.55%、寄生虫は 0.31% でした。残りの 53 サンプルでは腸内病原体は検出されませんでした (図 1)。したがって、QIAstat-Dx プラットフォームを使用したウイルス検出 (14.32% 対 0.85%) は、Luminex 200 分析よりも高感度でした。

QIAstat-Dx プラットフォームと Luminex 200 プラットフォームを使用した水媒介病原体の検出。濃縮水サンプルは、各プラットフォームの消化管パネルカートリッジにロードされました。核酸の抽出、増幅、検出は、QIA-stat-Dx プラットフォーム上で、または xTAG 胃腸病原体パネル用の EZ1 核酸ミニキット v2.0 を使用して自動的に実行されました。 64 サンプルのうち、QIA-stat-Dx プラットフォームは、細菌 (青色のバー)、ウイルス (オレンジ色のバー) について、それぞれ陽性率 4.69%、14.32%、5.31%、陰性率 95.31%、85.67%、94.68% を検出しました。および寄生虫 (灰色のバー)。 Luminex プラットフォームは、細菌、ウイルス、寄生虫の陽性率 0.85%、1.55%、0.31%、陰性率 99.15%、98.42%、99.68% を検出しました。 POS: 陽性サンプルの総数 vs. NEG: 陰性サンプルの総数。パーセンテージは、特定の病原体に対して陽性のサンプルの数を示します。

各プラットフォームのパフォーマンスと一致度を表 3 にまとめます。大腸菌 (st/it) では 27% (3/13)、ノロウイルス GI では 50% (4/8)、および 20% の一致が観察されました。アデノウイルス F40/F41 (2/10)。クロストリジウムディフィシル毒素 A/B は、Luminex 200 プラットフォームでのみ検出されました (64 サンプル中 1 サンプル)。 2 つの処理サンプルで陽性検出が観察されましたが、胃腸病原体は検出されませんでした。確認のため、Luminex 200 プラットフォームでテストが繰り返されました。 19 のターゲット (QIAstat-/Luminex+、QIAstat+/Luminex-) について一致しない結果が観察されました。 QIAstat-Dx プラットフォームは、Luminex 200 プラットフォームでは検出されなかった 12 種類の胃腸炎病原体を検出しました。これには、エルシニアエンテロコリチカ、腸内病原性大腸菌、腸内凝集性大腸菌、ビブロコレラ、腸内浸潤性大腸菌/赤癬菌、サポウイルス、ロタウイルス A、アストロウイルス、ノロウイルスGII、ランビア鞭毛虫、赤ん坊赤ん坊、カンピロバクター属。 5 つのターゲット (腸炎ビブリオ、ビブリオバルニフィカス、プレシオモナスシゲロイデス、シクロスポラカエタネンシス、STEC O157) は、両方のプラットフォームで低い検出率を示しました。

冷却システム、特にオープンウォーターシステムは、多くの微生物やバイオフィルムの増殖をサポートします。これらを制御しないと、重大な悪影響が生じます。汚染は、効果的な微生物モニタリング、検査、制御戦略からなる最適化された水処理プログラムを使用して制御できます。ここでは、エンテロウイルスを含む微生物を検出するための 2 つの高度なプラットフォームの包括的な分析を実行しました。私たちの分析により、QIAstat-Dx プラットフォームは水系病原菌の検出において Luminex 200 よりも 3 倍効果的であること、および KSA での現在の消毒手順がこれらの微生物の除去に効果的であることが示されました。したがって、我々はサウジアラビアの処理水サンプルにおけるこれら 2 つの分子検出法の最初の系統的な分析を提供します。

冷却塔からの病気の発生は、主に不適切な水と化学処理が原因で死亡者を引き起こしています。クレブシエラ属衛生水システムの自然の住人であり、栄養豊富な条件下で増殖することができます。それらの摂取または汚染されたエアロゾルを介した感染は、特に免疫力が低下した人において肺炎を引き起こす可能性があります。廃水処理計画は病原性ヒトウイルスに合わせて設計することができますが、これらは地理的地域と人口内で循環しているウイルスの種類によって異なります。一次および二次処理プロセスはウイルス力価を低下させることができますが、この目的のために特別に設計されたものではありません。ろ過、膜技術、UV 光システムなどの三次処理が、多重バリアアプローチとしてよく使用されます。ウイルスを含むエアロゾルによる集団へのリスクは現時点では理論上のものであり、公表された大発生の報告はありません。さらに、ウイルスは宿主の外で複製することはなく、ウイルスの運命は温度、湿度、太陽光などのさまざまな環境要因に依存します。しかし、ロタウイルスやアデノウイルスなどの腸内ウイルスは、立ち入り禁止区域の景観の灌漑中に人間の健康にリスクをもたらすことが認識されています。効果的なモニタリングの鍵は、水系病原体の研究に使用される分離手順に自信があることです。 2 回の超遠心分離後に評価したすべての水サンプルでウイルスのピーク回収率が観察されました。水サンプルの濃縮により、QIAstat-Dx プラットフォームでは 59.34% の回収率が得られたのに対し、Luminex 200 プラットフォームでは 6.2% となり、その優れたパフォーマンスが改めて強調されました。したがって、ウイルス回収率を最大化し、正確なサンプル分析を保証するための最適な分離手順と分析手順の両方を強調します。

一般的な消毒方法である次亜塩素酸ナトリウムなどの一次殺生物剤の使用では、処理排水からウイルスを単独で効果的に除去することはできず、リスクを効果的に制御するには複数のバリアアプローチが必要になることがよくあります。冷却システムは、原生動物、藻類、菌類、レジオネラ菌やクレブシエラ菌などの細菌などの微生物が増殖できる環境を提供します。バイオエアロゾルによる人間の曝露は、一体型ドリフトエリミネーターからの「ドリフト」、冷却塔盆地からの直接の「風損」、および構造的漏洩による逃亡曝露に関連しています。水温が 20 ～ 50 °C (68 ～ 122° F) の範囲である場合、冷却塔では微生物が増殖する可能性があります。したがって、水処理、運用管理、メンテナンスの実践が必要になります。適切な設計であっても、吸入できるほど小さい水滴 (つまり、直径 < 5 μm) がドリフトエリミネーターから離れる可能性があります 9、10、11。あるパイロット研究の結果は、TSE が工業用冷却システムの地下水に代わる実行可能な代替手段であり、世界中で使用できる可能性があることを示しました。冷却塔内の微生物の増殖は、一次殺生物剤として 12.5% 次亜塩素酸ナトリウムを使用して再循環水を継続的に消毒することで制御できます。堅牢な操作手順、高度なウイルス検査技術、資格のある専門家による継続的なガバナンスと監視を含む包括的な水処理システムは、人間の健康に対する有害なリスクの管理と制御に不可欠です。冷却塔システムで TSE を広く使用できるようにするには、消毒および非酸化性殺生物処理の有効性を判断する必要があります。私たちの分析により、このような病原体を除去するためのサウジアラビア南部の現在の消毒手順に確信がもてました。

このパイロット研究は、冷却塔からの処理水サンプル中の胃腸炎関連病原体の存在を評価するための 2 つの分子検出法の最初の体系的な分析を提供します。我々は、現在の上下水処理プロトコルがウイルス病原体を効率的に根絶できることを示し、最も感度の高い検出技術としてマルチプレックス PCR (QIAstat-Dx) を推奨します。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 [およびその補足情報ファイル] に含まれています。

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キングファイサル専門病院および研究センターの科学的支援と協力に感謝いたします。この研究のためのサンプル収集にご協力いただいた現場のエンジニアに感謝いたします。

このプロジェクトはサウジアラビア石油会社から資金提供を受けました。

サウジアラムコ、アルミドラタワー、9階、ダーラン、サウジアラビア、環境保護、職場環境部門、環境保健ユニット

ファワズ・A・アル・ウォハイブ & ハッサン・アル・ゼイン

サウジアラビア、リヤドのキングファイサル専門病院および研究センター、感染免疫部門、免疫不全宿主研究セクション

イブティハイ・アル・シャリフ、ドナ・ムラド、レイラ・アル・ハルビ、マハ・アル・モザイニ

サウジアラビア、リヤドのキング・サウード大学応用医科学部臨床検査科学科

マハ・アル・モザイニ

サウジアラビア、リヤドのアルファイサル大学医学部

マハ・アル・モザイニ

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概念化、FW および MM。方法論、IA および MM。正式な分析、LA、DM、HZ。調査、MM; データキュレーション、FWおよびHZ。執筆—初稿準備、MM。執筆 - レビューと編集、FW、HZ、MM。監修MM; プロジェクト管理、FW。資金調達、MM すべての著者は原稿の出版版を読み、同意しました。

マハ・アル・モザイニへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Al-Wohaib, FA、Al-Sharif, I.、Al-Zain, H. 他サウジアラビア東部州の処理下水中の胃腸炎病原菌の 2 つの分子検出プラットフォームの評価。 Sci Rep 12、21744 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-25702-4

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受信日: 2022 年 5 月 18 日

受理日: 2022 年 12 月 2 日

公開日: 2022 年 12 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25702-4

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