ACSS2

Scientific Reports volume 13、記事番号: 1483 (2023) この記事を引用

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アルカリリプトーシスは、腫瘍治療に使用される最近発見された pH 依存性細胞死の一種です。 しかし、その根底にある分子機構と制御ネットワークはほとんど知られていません。 今回我々は、酢酸活性化酵素であるアセチルCoA短鎖シンターゼファミリーメンバー2（ACSS2）が、ヒト膵管腺癌（PDAC）細胞におけるアルカリトーシスの正の制御因子であることを報告する。 qPCR およびウェスタンブロット分析を使用して、ACSS2 の mRNA およびタンパク質の発現が、古典的なアルカリトーシス活性化因子 JTC801 に応答してヒト PDAC 細胞株 (PANC1 および MiaPaCa2) で上方制御されることを発見しました。 その結果、shRNA による ACSS2 のノックダウンは、PDAC 細胞における JTC801 誘発細胞死を阻害し、細胞クローン形成の増加と細胞内 pH の低下を伴いました。 機械的には、ACSS2を介したアセチルコエンザイムAの産生とそれに続くヒストンのアセチル化がNF-κB依存性のCA9ダウンレギュレーションに寄与し、この効果はヒストン脱アセチラーゼ阻害剤トリコスタチンAによって増強された。これらの発見は、アルカリトーシスの代謝基盤を理解するための新たな洞察を提供する可能性がある。 PDAC 治療の潜在的な戦略を確立します。

制御細胞死 (RCD) にはさまざまな種類があり、重要な形態学的、生化学的、遺伝的特徴を示します 1。 アポトーシスは、RCD の最もよく研​​究されている形態です。 これには膜結合アポトーシス体の形成が関与し、通常はカスパーゼファミリーによって媒介されます。 しかし、アポトーシス耐性は依然としてがん治療における主要な臨床課題です2。 最近、いくつかの形態の非アポトーシス細胞死がアポトーシス耐性を克服して、さまざまな種類の癌を治療することが報告されています3。 その中でも、アルカリトーシスは pH 依存性の RCD であり、ヒト膵管腺癌 (PDAC) 細胞を死滅させる薬剤スクリーニングによって初めて特定されました 4。 低分子化合物 JTC801 は現在、典型的なアルカリトーシス誘導剤であり、核内因子カッパ B (NF-κB) の活性化に依存し、代わりに疼痛ペプチド受容体の選択的アンタゴニストとしてよく知られた機能を果たします 4。 JTC801 媒介の NF-κB 活性化は、炭酸脱水酵素 9 (CA9) の発現を阻害します。炭酸脱水酵素 9 (CA9) の生成物は pH バランスを調節し、最終的に細胞膜破裂を伴うアルカリトーシスを引き起こします4。 pH恒常性のメカニズムと制御をさらに理解することで、アルカリトーシスに基づく治療の抗がん活性が向上する可能性があります5。

アセチル補酵素 A (AcCoA) は、エネルギー生産、脂質代謝、およびエピゲノム修飾において中心的な役割を果たす代謝産物です6。 AcCoA ホメオスタシスはヒストンのアセチル化レベルに直接影響を及ぼし、それによって遺伝子発現を制御します7。 AcCoA は通常、2 つの経路を通じて生成されます6。 1 つは ATP クエン酸リアーゼ (ACLY) によって媒介され、クエン酸をオキサロ酢酸とアセチル CoA に分解します。 もう 1 つは、酢酸と CoA を連結するアセチル CoA シンターゼ短鎖 (ACSS) ファミリーによって媒介されます。 ACSS ファミリには、異なる細胞内の位置と機能を持つ ACSS1、ACSS2、および ACSS3 が含まれます。 ACSS1 と ACSS3 は主にミトコンドリアに存在し、ミトコンドリアの酸化的リン酸化に関与しますが、ACSS2 は主に核と細胞質に存在します 8。 核の A​​CSS2 は、ヒストンの脱アセチル化によって放出された酢酸を再捕獲し、ヒストン アセチルトランスフェラーゼによる再利用を行います 9。 ACSS2 は酢酸塩を使用して、新たな脂質生成とヒストンのアセチル化のために AcCoA を提供します 10。 ACSS はさまざまながん細胞の生存とアポトーシスの制御に役割を果たしていますが 11,12、アルカリトーシスにおける ACSS の役割はまだ不明です。

この研究では、NF-κBの活性化を維持し、その後ヒストンアセチル化を通じて細胞内pHを上方制御することにより、ヒトPDAC細胞のアルカリトーシスを媒介するACSS2の新たな役割を特定しました。 これらの発見は、発がん性または生存促進シグナルが細胞死を引き起こすために使用できるという考えを強化します。

ACSS2 (3658)、GAPDH (5174)、p-IKKα/β (2697)、IKKα (11930)、p-NF-κB (3033)、IKBα (7217)、アセチル化リジン (9814)、IKKβ ( 8943)、NF-κB (16502)、p-IKBα (2859)、および CA9 (5648) は Cell Signaling Technology から入手しました。 PARP に対する抗体 (13371-1-1-ap) は Proteintech から入手しました。 JTC801 (S272201) は Selleck Chemicals から購入しました。 スタウロスポリン (62996-74-1) およびトリコスタチン A (58880-19-6) は MedChemExpress から購入しました。

PANC1 (CRL-1469)、MiaPaCa2 (CRL-1420)、および CFPAC-1 (CRL-1918) 細胞株は、American Type Culture Collection から入手しました。 細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。 細胞培養物を、5% 二酸化炭素を含む 37 °C のインキュベーター内に置きました。 細胞株はショートタンデムリピートプロファイリングによって検証され、ルーチンのマイコプラズマ検査では汚染は陰性でした。 ジメチルスルホキシド (DMSO) は、薬物のストック溶液を調製するために使用されました。 細胞内の薬物使用溶液中のDMSOの最終濃度は<0.01%でした。 すべての細胞培養アッセイでは、0.01% の DMSO をビヒクル対照として使用しました 13。

アレイハイブリダイゼーションは、Agilent の単色マイクロアレイベースの遺伝子発現解析プロトコール (Agilent Technology)14 に従って実行されました。 RNA の量と質は NanoDrop ND-1000 によって測定されました。 RNA の完全性は、標準的な変性アガロースゲル電気泳動によって評価されました。 mRNA-ONLY真核生物mRNA単離キット(Epicentre)を使用して、rRNAを除去した後、全RNAからmRNAを精製した。 各サンプルから単離された全 RNA (100 ng) を cDNA に変換し、断片化し、GeneChip アレイにハイブリダイズさせました。 ハイブリダイゼーションアレイを洗浄、固定し、Agilent DNA マイクロアレイ スキャナー (P/N G2505C) を使用してスキャンしました。 GeneChip 3000 スキャナー (Affymetrix) を使用して、ハイブリダイズした GeneChip アレイの画像をスキャンし、定量化しました。 アレイ内の各プローブセルの強度値は、GeneChip ソフトウェアによって計算されました。

事前に設計されたヒト ACSS2-shRNA-1 (GCTTCTGTTCTGGGTCTGAAT)、ACSS2-shRNA-2 (CGGTTCTGCTACTTTCCCATT)、およびコントロールの空の shRNA (pLKO.1) は、レンチウイルス形式で Sigma-Aldrich から購入しました。 12ウェルプレートの各ウェルに500μlの完全培地に1×105個の細胞を播種し、10:1のMOIでレンチウイルスベクターによって形質導入しました。 形質導入はポリブレン(8μg/ml)の存在下で実施した。 完全培地で回復した後、ピューロマイシン (5 μg/ml) を形質導入細胞の選択に使用しました 13。

細胞を氷冷RIPAバッファー(9806、Cell Signaling Technology)中で4℃で溶解し、簡単な遠心分離(13,000×g、15分、4℃)によって細胞溶解物を清澄化した。 上清を、示された抗体による免疫沈降に使用しました。 一般に、2 mg の抗体を上清に添加し、4 °C で一晩インキュベートしました。 次に、30μlのプロテ​​インGまたはAセファローススラリーを添加し、サンプルを4℃でさらに2時間インキュベートしました。 インキュベーション後、ビーズをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で十分に洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル電気泳動の前に 2 × ドデシル硫酸ナトリウム サンプル緩衝液中で沸騰させることによってタンパク質を溶出しました4。

細胞を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル (Cell Signaling Technology、5872) を含む細胞溶解バッファー (Cell Signaling Technology、9803) 中で氷上で 30 分間、1 回溶解しました 13。 4℃、14,000×gで15分間遠心分離した後、上清を収集し、ビシンコニン酸（BCA）アッセイ（Thermo Fisher Scientific、23225）を使用して定量しました。 30 μg のタンパク質を 10% ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE) ゲル (Epizyme、PG112) で分離し、ポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Millipore、IPVH00010) に転写しました。 5% スキムミルクを含む TBST で 1 時間ブロッキングした後、メンブレンをさまざまな一次抗体 (1:200 ～ 1:1000) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 ペルオキシダーゼ結合二次抗体 (ウサギ抗ヤギ IgG 二次抗体 [Abcam、ab6741; 1:1000]) と室温で 1 時間インキュベートした後、SuperSignal West Pico PLUS 化学発光基質 (Thermo Fisher Scientific、34580) を使用してシグナルを視覚化しました。 ）。 ブロットは、ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad) および Image Lab ソフトウェア (Bio-Rad) を使用して分析しました。 すべての実験は 5% CO2 および正常酸素状態で実行され、少なくとも 3 回繰り返されました。代表的な結果が示されています。

細胞生存率のレベルは、Cell Counting Kit-8 (CCK-8) キット (YEASEN、40203ES80) を製造業者のプロトコールに従って使用してアッセイしました15。 細胞を96ウェルプレートに播種し（1×104細胞/ウェル）、指定の化合物で24時間処理しました。 プレートの各ウェルについて、培地を、10μlのCCK-8溶液を含む100μlの新鮮な培地と交換した。 その後、培養物を細胞インキュベーターに戻し、60 ～ 90 分間放置しました。 450 nm での吸光度は、培養中の生細胞の数に比例しました。 細胞生存率は相対レベルとして表され、100% 細胞生存率を 1 として設定しました。

クローン原性アッセイでは、対照細胞または JTC801 処理細胞を 12 ウェル プレートに播種し (ウェルあたり 500 細胞)、培地を 2 日に 1 回交換しました。 コロニーが現れるまで、プレートを37℃で3週間インキュベートしました。 次いで細胞をメタノールで固定し、コロニーを0.4%クリスタルバイオレットで染色した。

細胞を6ウェルプレートの培地に2×105細胞/ウェルの密度で播種しました。 翌日、細胞を指定の処理とともにインキュベートしました。 その後、細胞をヨウ化プロピジウム (BestBio、BB-4131-1) で 5% CO2、37 °C のインキュベーター内で 20 ～ 30 分間染色しました。 形態学的変化は、倍率20倍の蛍光顕微鏡を使用して検査されました。 Countess II FL 自動セルカウンター (Thermo Fisher Scientific) を使用して、ヨウ化プロピジウム染色後の死細胞のパーセンテージをアッセイしました。 細胞死は相対レベルとして表され、100% の細胞死を 115 として設定しました。

全 RNA は、RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN、74034) を製造業者の指示に従って使用して抽出しました 15。 キットの gDNA Eliminator スピンカラムを使用して細胞溶解物を回転させ、ゲノム DNA を除去しました。 RNeasy MinElute スピンカラムを使用して全 RNA を精製しました。 次に、PrimeScript RT Master Mix (Takara、RR036A) を使用して 1 μg の RNA から第 1 鎖 cDNA を合成しました。 次に、4 μl の PrimeScript RT Master 反応ミックス、2 μl の遺伝子特異的エンハンサー溶液、1 μl の逆転写酵素、1 μl の遺伝子特異的アッセイプール (20 ×、2 μM)、および 12 RNase、DNase、およびゲノム DNA を含まない水で希釈した RNA μl。 C1000 Touch Thermocycler CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) で TB Green Premix Ex Taq II (Takara、RR820Q) を使用して qPCR を実行しました。 分析は、Bio-Rad CFX Manager ソフトウェア 2.0 を使用して実行されました。 データは RNA GAPDH に対して正規化され、変化倍数は 2-DDCt 法によって計算されました。 mRNA の相対濃度は、未処理グループに基づいて任意の単位で表され、値 1 が割り当てられました。

スタウロスポリン (500 nM) または JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した後の WT および ACSS2 ノックダウン細胞のアポトーシス率を評価するために、細胞を収集し、メーカーの説明に従ってアクティブ カスパーゼ 3/7 染色キット (Abcam、ab284532) を使用しました。説明書。 カスパーゼ 3/7 の蛍光ピークは、FL-1 チャンネルを使用したフローサイトメトリー (BD FACSVerse、Becton、Dickinson and Company) によって分析されます。

細胞サンプルの PI 染色では、細胞を収集し、結合バッファー (BD biosciences、No. 556570) に再懸濁し、ヨウ化プロピジウム (2 mg/ml) で染色しました。 データは BD FACSVerse で収集および分析されました。

細胞外pHは、pHメーター(Seven Compact S210 pH/OPRメーター、メトラー・トレド装置、米国)を使用して、製造業者のガイドラインに従って測定した。 細胞内 pH は、蛍光発生細胞質 pH 指示プローブ (Thermo Fisher Scientific) を使用して測定しました。 プローブの蛍光強度は細胞内 pH の指標となります。 中性 pH では弱い蛍光ですが、pH が低下すると蛍光が増します。 この試薬は、509/533 nm の励起/発光で、pKa が約 6.5 で、9 ～ 4 の範囲の細胞サイトゾル pH を定量できます。 その後、細胞内 pH キャリブレーション バッファー キット (P35379) を使用すると、この細胞内 pH を定量化できます。 簡単に説明すると、細胞を Live Cell Imaging Solution (LCIS) で洗浄し、次に 10 μl の pHrodo™ Red AM または pHrodo™ Green AM を 100 μl の PowerLoad™ 濃縮液と混合し、10 ml の LCIS に加えました。 細胞を pHrodo™ AM/PowerLoad™/LCIS とともに 37 °C で 30 分間インキュベートし、その後 Cytation™ 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek, USA) を使用して 509/533 maxima4 を使用して分析しました。

細胞のアセチル-CoAは、アセチル-CoAアッセイキット(Sigma、MAK039)を製造業者のプロトコールに従って使用して測定した。 簡単に言うと、細胞に過塩素酸を加えて均質化しました。 遠心分離（10,000×g、10分間、4℃）後、400μlの上清を40μlの飽和KHCO3で中和し、10,000×gで5分間、4℃で遠心分離した。 アセチル CoA 標準曲線は、提供されたさまざまな濃度 (0 ～ 1000 pmol/ml) のアセチル CoA 標準を使用して作成されました。 バックグラウンド値は標準から除去され、サンプルの濃度は、Cytation™ 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek, USA) を使用して 535/587 最大値を使用して計算されました。

データは、別段の指示がない限り、平均値 ± SD として表示されます。 データの収集と分析には、GraphPad Prism (バージョン 8.4.3) が使用されました。 対応のないスチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループの平均を比較しました。 テューキーの多重比較検定による一元配置 (1 つの独立変数に対する) 分散分析 (ANOVA) を、すべてのペアごとの組み合わせに関する異なるグループ間の比較に使用しました。 図では次の表記が使用されました:*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。 ns: 重要ではありません。

がん細胞は、その生存と急速な増殖をサポートするために、さまざまな代謝再プログラミングイベントを必要とします。 これらの生存促進経路は、標的療法のための新しい戦略を設計する機会を提供します。 アルカリトーシスの代謝基盤を解明するために、我々は腫瘍細胞増殖の制御因子を共有する解糖と一炭素代謝に焦点を当てました16。 JTC801で処理したヒトPDAC（MiaPaCa2、PANC1、およびCFPAC1）細胞のDNAマイクロアレイの結果を分析したところ、ACSS2およびヘキソキナーゼドメイン含有1（HKDC1）は、すべての細胞株において解糖および一炭素代謝の遺伝子が上方制御されていました（図1A） ）。 その後の qPCR 分析により、JTC801 処理後に ACSS2 mRNA が MiaPaCa2 細胞と PANC1 細胞の両方で上方制御されていることが確認されました (図 1B)。 ACSS2 は主に脂質代謝に関与しているため、重要な脂質代謝遺伝子を調べるために qPCR も使用しました。 脂質代謝に関連する他の遺伝子（ACSS1、脂肪酸合成酵素（FASN）、MYC、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ1（PDK1）、ヘキソキナーゼ2（HK2）、前方勾配2、プロテインジスルフィドイソメラーゼファミリーメンバー（AGR2）など） ）は、PANC1細胞またはMiaPaCa2細胞でもさまざまな程度に上方制御されました（図1C）。 さらに、ウェスタンブロット分析により、JTC801がMiaPaCa2細胞およびPANC1細胞において用量依存性および時間依存性でACSS2タンパク質の上方制御を誘導することが示されました（図1D、E）。 対照的に、PANC1細胞ではACSS2のタンパク質レベルはスタウロスポリン（アポトーシス誘導剤）によって上方制御されなかった（図1F）。 これらの所見を総合すると、ACSS2 はアポトーシスではなくアルカリトーシス中に上方制御されることが示されています。

ACSS2はアルカリトーシス中に上方制御されます。 (A) 細胞を JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した後の DNA マイクロアレイ研究から、膵臓がん細胞 (MiaPaCa2、PANC1、および CFPAC-1) のグルコース代謝と炭素代謝に関与する上方制御された遺伝子を分析しました。 （B）JTC801（3μM）で24時間処理したMiaPaCa2細胞およびPANC1細胞におけるACSS2およびHKDC1のmRNAのqPCR分析（n = 3の生物学的に独立したサンプル）。 (C) JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した MiaPaCa2 および PANC1 細胞における ACSS1、ACSS2、FASN、MYC、AGR2、PDK1、および HK2 の mRNA の qPCR 分析。 (D) 示された JTC801 で 24 時間処理した後の、MiaPaCa2 細胞および PANC1 細胞における ACSS2 タンパク質発現のウェスタンブロット分析。 膜を切り取って、示された抗体を調べました。 定量的結果は右側のパネルにプロットされています。 (n = 3 生物学的に独立したサンプル、対応のない t 検定)。 （E）JTC801（3μM）で6〜24時間処理した後のMiaPaCa2細胞およびPANC1細胞におけるACSS2タンパク質発現のウェスタンブロット分析（n = 3の生物学的に独立したサンプル、対応のないt検定）。 ベータアクチンをローディングコントロールとして調べました。 定量的結果は右側のパネルにプロットされています。 (F) JTC801 (3 μM) またはスタウロスポリン (500 nM) で 24 時間処理した後の、MiaPaCa2 細胞および PANC1 細胞における示されたタンパク質発現のウェスタンブロット分析。 PARP の膜を剥がし、ACSS2 を再プローブしました。 メンブレンをリブロット溶液中で 30 分間インキュベートし、TBST 含有スキンミルク (5%) を用いて室温で 30 分間ブロックし、抗 ACSS2 (Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer、46430、サーモサイエンティフィック)。 定量的結果は右側のパネルにプロットされています。

上方制御された ACSS2 がアルカリトーシスに関与しているかどうかを判断するために、2 つの特異的な shRNA を使用して ACSS2 ノックダウン PDAC 細胞を生成しました。 ウエスタンブロッティングにより、ACSS2ノックダウンMiaPaCa2細胞およびPANC1細胞において、ACSS2のタンパク質レベルが70％を超えて阻害されたことが確認された（図2A）。 対照群と比較して、ACSS2ノックダウンMiaPaCa2細胞およびPANC1細胞の細胞増殖は72時間で阻害され（図2B）、ACSS2が増殖因子であるという以前の発見を裏付けた。 重要なことに、ACSS2のノックダウンは、MiaPaCa2細胞およびPANC1細胞におけるJTC801誘導性の増殖阻害を24時間で阻害し（図2C）、JTC801に応答したACSS2の異なる細胞死促進の役割を強調した。 短期細胞生存率アッセイと一致して、長期細胞クローニングアッセイは、対照群と比較して、JTC801で処理したACSS2ノックダウン細胞がより高い増殖能力を有することを示した(図2D)。 細胞膜破裂を測定するためのヨウ化プロピジウム（PI）染色の使用により、ACSS2がアルカリトーシスの正の調節因子であるという仮説がさらに確認されました（図2E、図S2）。 以前の研究11,12と一致して、ACSS2ノックダウン細胞は、切断されたポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ-1(PARP1)のウェスタンブロット分析およびカスパーゼ-3/7活性のフローサイトメトリー分析によって示されるように、スタウロスポリン誘導性アポトーシスに対して耐性を示した。 (図2F、G)。 これらのデータは、JTC801 誘発性アルカリトーシスの促進における ACSS2 の異なる役割を確立します。

ACSS2 はアルカリトーシスの正の制御因子です。 (A) 示された ACSS2 ノックダウン細胞株における ACSS2 タンパク質発現のウェスタンブロット分析 (n = 3 の生物学的に独立したサンプル)。 膜を切り取って、示された抗体を調べました。 定量的結果は右側のパネルにプロットされています。 (B) 24 ～ 72 時間における指定細胞の細胞生存率の分析 (n = 3 生物学的に独立したサンプル)。 (C) JTC801 (1 ～ 5 μM) で 24 時間処理した後の、示された細胞における細胞生存率の分析 (n = 3 の生物学的に独立したサンプル)。 (D) 示されたコントロールまたは JTC801 処理 PANC1 および MiaPaCa2 細胞における細胞クローニング形成の分析。 定量的結果は下のパネルにプロットされています。 (E) JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した後の指定の細胞における PI 染色による細胞死の分析 (n = 3 生物学的に独立したサンプル)。 バー = 200 μm。 定量的結果を下のパネルにプロットします。 (F) スタウロスポリン (500 nM) または JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した後の、示された細胞における ACSS2 および C-PARP タンパク質発現のウェスタンブロット分析 (n = 3 の生物学的に独立したサンプル)。 膜を切り取って、示された抗体を調べました。 PARP の膜を剥がし、ACSS2 を再プローブしました。 メンブレンをリブロット溶液中で 30 分間インキュベートし、TBST 含有スキンミルク (5%) を用いて室温で 30 分間ブロックし、抗 ACSS2 (Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer、46430、サーモサイエンティフィック)。 (G) スタウロスポリン (500 nM) または JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した後の、示された細胞におけるカスパーゼ 3/7 活性のフローサイトメトリー分析 (n = 3 の生物学的に独立したサンプル)。

細胞内 pH の上昇はアルカリトーシスを引き起こす重要な代謝事象であるため 4、細胞内 pH を検出するように設計された pH 蛍光プローブを使用しました。 予想通り、JTC801 は MiaPaCa2 細胞および PANC1 細胞の細胞内 pH を上昇させました (図 3A)。 対照的に、ACSS2発現の抑制は、JTC801誘導性の細胞内pH上方制御を有意に遮断した(図3A)。 明確な対照として、pHテストストリップによって測定された細胞外pHは、対照細胞およびACSS2ノックダウンMiaPaCa2およびPANC1細胞においてJTC801の影響を受けなかった(図3B)。 これらの発見は、ACSS2が細胞外pHではなく細胞内pHの上方制御を通じてアルカリトーシスを促進することを示唆しています。

ACSS2 媒介ヒストン アセチル化は、アルカリトーシスにおける細胞質の酸性化を阻害します。 (A、B) JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した後、示された MiaPaCa2 および PANC1 細胞で細胞内および細胞外の pH 値が検出されました (n = 3 生物学的に独立したサンプル)。 (C) JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した後の指定の MiaPaCa2 および PANC1 細胞におけるアセチル CoA レベルの ELISA 分析 (n = 3 の生物学的に独立したサンプル)。 (D) JTC801 (3 μM) およびトリコスタチン (TSA; 200 nM) で 24 時間処理した後、示された MiaPaCa2 および PANC1 細胞で細胞内 pH 値が検出されました (n = 3 生物学的に独立したサンプル)。 (E) JTC801 (3 μM) およびトリコスタチン (TSA; 200 nM) で 24 時間処理した後、示された MiaPaCa2 および PANC1 細胞で細胞外 pH 値が検出されました (n = 3 生物学的に独立したサンプル)。

アルカリトーシスにおける ACSS2 の役割をさらに定義するために、AcCoA の細胞内レベルをアッセイしました。 JTC801は、対照細胞において細胞内AcCoAの上方制御を誘導したが、ACSS2ノックダウンMiaPaCa2細胞およびPANC1細胞においては誘導しなかった(図3C)。 ヒストンのアセチル化を増強できる広範な脱アセチラーゼ阻害剤であるトリコスタチン A (TSA) 17 は、野生型細胞および ACSS2 ノックダウン細胞において細胞内または細胞外の pH 上方制御を誘導できませんでした (図 3D、E)。 全体として、これらの発見は、ACSS2 が JTC801 誘発アルカリトーシスの際の AcCoA 産生と細胞内 pH 上方制御を媒介することを示しています。

ACSS2 媒介 AcCoA 産生の重要な機能の 1 つは、ヒストン アセチル化を通じて遺伝子転写を制御することです 10。 NF-κB の活性化がアルカリトーシスを引き起こす重要なシグナル伝達事象であることを考慮すると 4、我々は次に、JTC801 に応答する野生型細胞および ACSS2 ノックダウン細胞におけるヒストンのアセチル化と NF-κB 経路との関係を調べました。

IKK キナーゼ複合体は、2 つのキナーゼ (IKKα および IKKβ) と、NF-κB カスケードの中心要素である調節サブユニット NEMO/IKKγ で構成されています 18。 IKK は IκBα タンパク質をリン酸化し、その後の IκBα ユビキチン化を引き起こし、最終的にはプロテアソームによって分解されます 18。 IκBα が NF-κB (RelA および p50) から解離した後、活性化された NF-κB が細胞質から核に移動し、そこで遺伝子転写が開始されます 18。 ウェスタンブロットの結果は、JTC801がヒストンアセチル化リジン（AC-K2-100）（図S3Cおよび図3D）およびNF-κB経路のコアコンポーネント（IKKα、IKKβ、およびNF-κB経路）のタンパク質発現を上方制御することを示しました。 MiaPaCa2細胞におけるκB）（図4A、B）、および細胞生存率アッセイは、酢酸塩がJTC801に対するMiaPaCa2細胞およびPANC1細胞の感受性を増加させることを示しました（図S4）。 対照的に、ACSS2のノックダウンはこのプロセスを逆転させ、NF-κBリン酸化イベントの減少およびCA9発現の増加と関連していた(図4A、B)。 私たちの coIP 実験は、ACSS2 をノックダウンした細胞株における NF-κB のアセチル化レベルを示しています (図 4C)。 また、ACSS2ノックダウン後のアセチル化レベルとCA9発現もウェスタンブロットによって検出しました（図S3AおよびS3B）。 これらの所見は、ACSS2 が JTC801 誘発性アルカリトーシス中に NF-κB 媒介 CA9 ダウンレギュレーションを維持することを示しています。 陽性対照として、CoCl2 誘発性低酸素症中に CA9 が上方制御されました (図 S5)。

ACSS2 媒介ヒストン アセチル化はアルカリトーシスを促進します。 (A、B) JTC801 (3 μM) で 24 時間処理した後のコントロールまたは ACSS2 ノックダウン細胞株における示されたタンパク質発現のウェスタンブロット分析 (n = 3 生物学的に独立したサンプル)。 代表的なウェスタンブロットの結果を左のパネルに示します。 膜を切り取って、示された抗体を調べました。 p-IKKα/βの膜を剥がし、IKKαおよびIKKβについて再プローブした。 メンブレンをリブロット溶液中で 30 分間インキュベートし、TBST 含有スキンミルク (5%) を用いて室温で 30 分間ブロックし、抗 IKKα を用いて 4 °C で一晩プローブしました。 上記の手順を繰り返して、抗 IKKβ 抗体でメンブレンを再プローブします。 p-NFκB の膜を剥がし、ACSS2 を再プローブしました。 p-IκBαの膜を剥がし、IκBαとGAPDHを再プローブしました。 CA9のタンパク質発現を、5%CO2および正常酸素下でJTC801(3μM)で24時間処理した後、示された細胞株で測定した。 定量的結果は右側のパネルにプロットされています。 (C) MIAPaCa2 細胞および PANC1 細胞におけるコントロールまたは ACSS2 ノックダウン。 細胞溶解物をcoIP用に抽出し、示された抗体および左パネルに示す代表的なウェスタンブロットを使用して免疫沈降物を分析しました。 Ac-lys の膜を剥がし、NFκB を再プローブしました。 (D) コントロールまたは ACSS2 ノックダウン細胞株を、トリコスタチン (TSA、200 nM) の非存在下または存在下で JTC801 (1 ～ 5 μM) で 24 時間処理し、細胞生存率をアッセイしました (n = 3 生物学的に独立したサンプル) 。 (E) JTC801 誘発性アルカリトーシスにおける ACSS2 の役割の概略図。

次に、TSAがACSS2ノックダウンMiaPaCa2細胞におけるアルカリトーシスの抑制効果を逆転できるかどうかを調べました。 細胞生存率アッセイにより、TSAがACSS2ノックダウンMiaPaCa2細胞のJTC801に対する感受性を回復することが示された(図4D)。 対照的に、野生型細胞におけるTSAとJTC801の相乗効果は弱かった（図4D）。

PDAC は現在、消化器系の癌の中で最も致死率が高く、全体の 5 年生存率は約 10% です。 アポトーシスを誘導する現在の化学療法と比較して、非アポトーシス性 RCD (アルカリトーシスを含む) は PDAC19 の治療に新たな機会を提供します。 この研究では、ACSS2がヒトPDAC細胞のNF-κB経路を活性化することによりアルカリトーシスの新しい制御因子であることを実証しました（図4E）。 ACSS2はアポトーシス耐性を媒介することができますが、PDAC細胞におけるJTC801誘導性アルカリトーシス中に上方制御されます。 これらの発見は、ACSS2 が刺激に応じて細胞死において二重の役割を果たすことを裏付けています。 アルカリトーシスの誘導は、ACSS2 発現が高い PDAC の治療に有用な方法である可能性があります。

組織特異的な ACSS1 および ACSS3 と比較して、ACSS2 の発現はさまざまな組織に広がっています 20。 前臨床研究では、ACSS2 が酢酸塩を利用してヒストンのアセチル化を媒介できることが示されており、これは遺伝子発現、細胞増殖、および癌の発生の調節において重要な役割を果たしています 9,10。 今回の研究で、我々は、JTC801 誘発性アルカリトーシスには、この ACSS2 依存性ヒストン アセチル化経路が必要であることを実証しました。 JTC801 誘発アルカリトーシスの全体的な遺伝的変化は今後も研究する必要がありますが、ACSS2 ノックダウン PDAC 細胞では NF-κB 経路の発現と活性化が損なわれていることを発見しました。 ACSS2 と同様に、NF-κB は通常、アポトーシスを阻害する生存促進因子です。 しかし、アルカリトーシスは部分的に NF-κB の活性化に依存して CA9 の発現を阻害し、細胞内 pH4 の上昇を引き起こします。 細胞内 pH の上昇は、モノカルボン酸トランスポーターに依存する全体的なヒストン アセチル化をさらに加速する可能性があります 21。 全体として、これらの発見は、生存促進シグナルまたは経路を使用して PDAC 細胞の細胞死を引き起こすための潜在的な戦略を確立します。

ヒストンアセチル化による遺伝子転写のエピジェネティックな調節を媒介することに加えて、腫瘍生物学における ACSS2 を含む ACSS ファミリーのもう 1 つの重要な機能は、腫瘍増殖のための脂肪酸合成を媒介することです 6。 脂肪酸合成は、FASN による AcCoA と NADPH からの脂肪酸の生成です。 それにもかかわらず、過剰な脂肪酸合成は、脂質過酸化依存性のフェロトーシスを活性化することによって細胞死を媒介する役割も果たしています。 特に、多価不飽和脂肪酸生合成経路は、フェロトーシスにおいて重要な役割を果たしています22。 しかし、初期の研究では、フェロスタチン-1 などのフェロトーシス阻害剤は JTC801 誘発細胞死を阻害できないことが示されています 4。 したがって、異なる RCD は一部の信号を共有する場合がありますが、エフェクターとフィードバック メカニズムは異なります。

アルカリリプトーシスは一般に、原形質膜の破裂と損傷関連分子パターン (DAMP) の放出を伴う制御性壊死の一種です。 高移動性グループボックス 1 (HMGB1) は、さまざまな RCD における代表的な核 DAMP であり、さまざまな免疫応答を引き起こす可能性があります。 例えば、HMGB1 は化学療法または放射線療法に応答してがん細胞によって放出され、周囲の抗原提示細胞を活性化して抗腫瘍免疫を達成します 23。 我々は最近、HMGB1 がアルカリ性損傷によって引き起こされる炎症反応のメディエーターであることを観察しました 24。 受動的放出に加えて、細胞外空間への HMGB1 の能動的分泌には、HMGB125 のアセチル化が必要です。 HMGB1 のアセチル化と放出がアルカリトーシスにおける ACCS2 アップレギュレーションに依存しているかどうかをさらに調べることが重要であり、これが PDAC に対する免疫療法の開発に有利になる可能性があります。

要約すると、我々は、ACCS2がヒストンのアセチル化を活性化することによるアルカリトーシスの新しい制御因子であることを証明した。 これらの発見は、バイオマーカーとして、およびアルカリトーシス媒介治療への寄与因子としてのACCS2の潜在的な重要性を強調しています5。

マイクロアレイ データは、アクセッション GSE206290 で GEO に寄託されています https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE206290 ボックスにトークン ynipqmqkvrmlrux を入力します。

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原稿を批判的に読んでくださった Dave Primm (テキサス大学サウスウェスタン医療センター外科) に感謝します。

DAMP 研究所、広州医科大学第三付属病院、広州、510120、広東省、中国

Dongwen Que、Feimei Kuang、Jiao Liu

UTサウスウェスタン医療センター外科、ダラス、テキサス州、75390、米国

ルイ・カン＆ダオリン・タン

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DT と JL が実験を考案し、計画しました。 DQ、FK、JL はシミュレーションとサンプル準備を実行し、データを分析しました。 DQ と DT が論文を書きました。 RK はデータ解釈を支援し、原稿を編集しました。 著者全員が批判的なフィードバックを提供し、研究、分析、原稿の形成に貢献しました。

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転載と許可

Que、D.、Kuang、F.、Kang、R. 他 ACSS2 媒介 NF-κB 活性化は、ヒト膵臓がん細胞のアルカリトーシスを促進します。 Sci Rep 13、1483 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-28261-4

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受信日: 2022 年 5 月 17 日

受理日: 2023 年 1 月 16 日

公開日: 2023 年 1 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28261-4

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