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Scientific Reports volume 12、記事番号: 16579 (2022) この記事を引用

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コットンラット (Sigmodon) は、呼吸器ウイルス病原体、特に呼吸器合胞体ウイルス (RSV) のゴールドスタンダード前臨床小動物モデルです。 しかし、参照ゲノムや公表されたトランスクリプトームがなければ、コットンラットでの遺伝子発現解析を必要とする研究は大幅に制限されます。 この研究の目的は、動物モデルとして一般的に使用される 2 種のコットンラット (Sigmodon fulviventer と Sigmodon hispidus) の複数の組織から包括的なトランスクリプトームを生成し、RSV 感染に対する遺伝子発現の変化と免疫応答を比較対照することでした。 2つの種。 トランスクリプトームは、コンティグ N50 > 1600 を持つ種ごとに肺、脾臓、腎臓、心臓、腸から集められました。コンティグのアノテーションにより、種ごとに約 120,000 の遺伝子アノテーションが生成されました。 次に、S. fulviventer および S. hispidus のトランスクリプトームを使用して、RSV 感染に対する免疫応答を評価しました。 我々は、RSV感染に関与するいくつかの遺伝子（例、Mx2、I27L2、LY6E、Viperin、Keratin 6A、ISG15、CXCL10、CXCL11、IRF9）やこれまで報告されていない新規遺伝子を含む、有意に差次的に発現する238個のユニークな遺伝子を同定した。 RSV 研究 (LG3BP、SYWC、ABEC1、IIGP1、CREB1)。 この研究は、コットンラットモデルにおける将来の遺伝子発現解析研究のためのリソースとして 2 つの包括的なトランスクリプトーム参考文献を提示するとともに、分子経路の機構的特徴付けのための遺伝子配列を提供します。 全体として、我々の結果は、宿主遺伝学の宿主-ウイルス相互作用への影響についての一般化可能な洞察を提供するとともに、RSVの治療と予防のための新しい宿主治療標的を特定するものである。

呼吸器合胞体ウイルス（RSV）は、2 歳未満の小児、免疫不全者および高齢者における下気道感染症（LRTI）の主な原因であり、その結果、3,300 万人の LRTI、320 万人の入院、およびほぼすべての患者が発生しています。世界中で毎年12万人が死亡しています1。 現在承認された RSV ワクチンはなく、予防用モノクローナル抗体 (パリビズマブ) は 1 つだけであり、コストの関係で使用は高リスクの小児に限定されています 2,3。 RSV LRTI 症例の 93% と RSV 死亡率の 99% が発展途上国で発生しているため、効果的なワクチンと低コストの予防薬の必要性が非常に重要です1。 1960 年代のホルマリン不活化 RSV ワクチンの失敗により、ワクチン接種者がウイルスに感染すると重症化が引き起こされ、新しい RSV ワクチンの開発は数十年間妨げられました 4-6。 しかし、最近、RSV 予防薬を開発する新たな取り組みが行われており、14 のワクチン候補と RSV に対する代替抗ウイルス戦略 (組換え抗体 7、ナノボディ 8、小分子阻害剤および類似体 9) が開発のさまざまな段階にあります 10。 これは、RSV に対するワクチンおよび薬剤開発のための適切な前臨床モデルの重要な必要性を強調しています。

コットンラット（シグモドン属）は、大多数の実験用マウスよりも RSV 感染に対して 100 倍寛容であり、RSV は上部と下部の両方に感染するため、マウスや他の動物と比較して RSV 感染の「ゴールドスタンダード」動物モデルと考えられています。人間と似た気道11-13。 コットンラットは、FDA が承認した 2 つの RSV 治療薬 (RespiGam®、Palivizumab®) の有効性も正確に予測しました 14-17。 RSV に加えて、コットンラットは、広範な感受性と広範な感受性のため、他の重要なヒト呼吸器ウイルス、すなわち、インフルエンザ A ウイルス 18,19、パラインフルエンザウイルス 20,21、麻疹 22、ヒトメタニューモウイルス 23、エンテロウイルス D6824、およびヒトライノウイルス 25 の研究に使用されています。ヒトの病気の特徴に匹敵する26。 残念ながら、ワタラットのトランスクリプトーム変化を比較する研究は、ワタラット種の公的に利用可能な参照ゲノムが不足しているため、限られています。 以前、我々は、S. hispidus において RSV によって誘導された肺組織トランスクリプトームを発表しました 27。 しかし、その研究では 1 つの組織タイプでの発現しか分析しておらず、コットンラットの 1 種 (S. hispidus) のみに限定されていました。 以前の研究が示すように、S. fulviventer 特異的と S. hispidus 特異的は両方とも、ウイルス病原体 (すなわち、パラインフルエンザ ウイルス 28、HIV29) に対する疾患の重症度およびマイクロバイオーム コミュニティ構造 30 が異なります。 この研究の主な目的は、両方の種の包括的なトランスクリプトームを開発し、RSV 感染時の遺伝子発現の変化を比較対照することでした。

この目的を達成するために、我々は健康な動物から採取した複数の組織（肺、脾臓、心臓、腎臓、結腸）の全RNAを配列し、2種のコットンラット（S. fulviventerとS. fulviventer）の機能的アノテーションを付けたde novoアセンブリを使用して包括的なトランスクリプトームを生成しました。ヒスピダス）。 次に、各種のコットンラットを未感染の対照とともに RSV A/Long 株に感染させ、トランスクリプトームリファレンスを使用して RSV 感染後に差次的に発現される遺伝子を決定しました。

包括的なトランスクリプトームアセンブリのために、生後 4 ～ 6 週間の健康な S. fulviventer および S. hispidus から採取した脾臓、心臓、腎臓、肺、および結腸の切片から全 RNA を抽出しました (補足表 1)。 RNA-seq ライブラリーは、サンプルあたり 5,000 万のペアエンド 2 × 150 の深さまで配列されました。 シーケンスリード QC の後、すべての健康な組織 (種ごとに n = 2、種ごとに肺 n = 4) からのデータをプールし、S. fulviventer の 4 億 5,600 万件のペアエンドリード (GC 含量 54.9%) と 4 億 6,500 万件のペアエンドリードを生成しました。 S. hispidus の場合 (GC 含量 53.1%)。 de novo アセンブリを使用して各種のトランスクリプトームを生成し、非感染対照と比較した感染動物の肺における RSV 誘発トランスクリプトーム変化を評価するための参照データベースとして使用しました。

種ごとに、5 つの組織タイプすべてからのシーケンスされたリードが結合されました。 Trinity31 は、50 倍の平均カバレッジを達成するためのインシリコ正規化後のコンティグ (「トランスクリプト」とも呼ばれます) の de novo アセンブリに使用されました。 アセンブラは種ごとに 130 万を超えるコンティグを生成し、長さ 32 と冗長性 33,34 に基づいてさらにフィルタリングしました (補足表 1)。 以下のアセンブリ統計を表 1 に示します。各転写産物には、各「遺伝子」 (S. fulviventer = 587,619、S. hispidus = 559,830) およびそれらの選択的にスプライシングされた「アイソフォーム」 (S. fulviventer = 620,569、 S.ヒスピダス = 592,099)。 両方の種から組み立てられた転写物は、GC 含量が 43%、コンティグ N50 > 1600 (これは、他の公開されているトランスクリプトーム アセンブリの N50 を超えています 35、36、37) でした。 Ex90N50 は N50 ですが、正規化された総転写産物の上位 90% に限定されており、2503 (S. fulviventer、#transcripts = 108,995) および 2162 (S. hispidus、#transcripts = 240,587) でした (表 1)。

転写物の数とその発現レベルは組織の種類によって異なり、いくつかの転写物は組織特異的であり、肺が最も多くの固有の転写物を有していた（S. fulviventer = 47,448、S. hispidus = 38,270）（図1A、B） ）。 他の転写物は、5 つの組織すべて (S. fulviventer = 216,307、S. hispidus = 225,833)、または 2 つ以上の組織タイプの組み合わせで見つかりました (図 1A、B)。 DESeq2 によって決定され、階層的ヒートマップ クラスタリングによって視覚化された 38 (図 1C、D) ように、多くの転写産物は組織間で差次的に発現されていました (S. fulviventer = 49,215、S. hispidus = 55,415)。 主成分分析では、種と組織サンプル間の遺伝子発現パターンに大きな違いがあり、これは種と組織タイプに基づく強力なクラスタリングによって示されます (図 1E)。 アセンブリ後、タンパク質配列データベース (SwissProt) を使用して転写産物に注釈を付け、他の種に対する相同性を検索しました。 両方の種について、転写物はハツカネズミ（54％）、ホモ・サピエンス（17％）およびドブネズミ（13％）と最も高い相同性を共有した（図1F）。

Trinity を使用した Sigmodon トランスクリプトーム アセンブリ。 (A、B) 両方の (A) S. fulviventer の脾臓 (青)、心臓 (緑)、腎臓 (赤)、結腸 (オレンジ)、および肺 (青) で発現された重複する組織特異的転写産物の UpSet プロット(n = 2) および (B) S. hispidus (n = 2)。 重複するシーケンスのバーは黒で表示され、個々の臓器に固有のシーケンスのバーは対応する色で表示されます。 重複する転写産物の数が各バーの上に表示され、個々の臓器の比較が Y 軸に表示されます。 組織ごとの固有の遺伝子の数は、水平棒グラフで表されます。 (C、D) (C) S. fulviventer と (D) S. hispidus の両方の個々の組織サンプル内の、差次的に発現されたすべての転写産物 (Q < 0.001、L2fc > 2、ユークリッド距離) の Z スコアによる階層的クラスタリングとヒートマップ。 (E) 両種の健康な組織内で発現された転写物の主成分分析 (PCA)。 (F) NCBI BlastX によって決定された遺伝子アノテーションの分類学的ソース。 データは S. fulviventer トランスクリプトームの注釈を表します。 S. hispidus は表示されていませんが、「その他」を除くすべてのカテゴリで ~ 1% 変動します。

アセンブリの品質を評価するため (表 1)、Bowtie239 を使用して完全なアセンブリを品質トリミングされたリードにマップし直したところ、リードの 81.9% と 87.9% が S. fulviventer と S. hispidus のトランスクリプトームのアセンブリ中にそれぞれ利用されたことがわかりました。 、> 70% は高品質を示します。 また、データセット内のvertebrata_odb10系統データセット（合計n = 3354）から進化的に保存されたBUSCO40グループを検索することにより、トランスクリプトームの完全性を評価しました。 S. fulviventer アセンブリには 92.7% の完全な BUSCO (完全:3109 [完全および単一:785、完全および複製:2324]、断片化:154、欠落:91) があり、S. ヒスピダスには 90.2% の完全な BUSCO (完全:3025 [完全および単一:2599]) がありました。 、完全&重複:426]、断片化:194、欠落:135)。 すべてのアセンブリ品質統計も表 1 に示します。各種の最終参照トランスクリプトーム アセンブリは、補足ファイル 1 (S. hispidus) および補足ファイル 2 (S. fulviventer) として利用できます。

トランスクリプトには、Trinotate パイプライン (https://trinotate.github.io/) を使用して機能的な注釈が付けられました。 トランスクリプトームのリファレンスは、種ごとに個別に生成されました。 まず、コットンラットの転写物を、配列相同性に基づいて、14,132 の異なる分類群 (http://web.expasy.org/docs/relnotes/relstat.html) の配列を含む非冗長タンパク質アノテーション データベース (UniProt41) と整列させました。 BLASTx42 経由 (カットオフ e 値 < 1e-05)。 我々は、各種について集められた約600,000の転写産物のうち、S. fulviventerの18,726の固有遺伝子を含む118,060の転写産物と、S. hispidusの18,380の固有の遺伝子を含む117,153の転写産物に注釈を付けた（表1）。 次いで、コード領域をオープンリーディングフレームに基づいて同定した(S. fulviventer = 118,159、S. hispidus = 113,999)。 タンパク質コード転写物は、UniProt データベース 41 に対して BLASTp42 (カットオフ e 値 < 1e05) を使用してアノテーションを付けられ、種あたり > 30,000 個のアノテーション付きタンパク質 (重複アノテーションをフィルタリングした後は約 17,000 個のタンパク質) を同定しました。 タンパク質には、タンパク質ドメイン (> 5000)、膜貫通ヘリックス (> 18,000)、およびシグナル伝達タンパク質 (> 7700) に基づいてさらに注釈が付けられました。 すべての注釈統計は表 1 にあり、完全な注釈レポートは補足ファイル 3 で参照できます。

遺伝子名のアノテーションに加えて、UniProt への BLAST アライメントでは、遺伝子とゲノムの京都百科事典 (KEGG) パスウェイ 43、遺伝子オントロジー (GO)44、EggNOG オーソロジー 45 など、遺伝子を説明するためのいくつかの機能用語も割り当てられました。 遺伝子オントロジー (GO) 用語は、遺伝子の機能特性と遺伝子相互の関係を説明します。 1 つ以上の GO 用語が、98.35% S. fulviventer の注釈付き転写物 (n = 116,115) および 98.45% の S. hispidus の注釈付き転写物 (n = 115,332) に割り当てられました。 GO 用語は、生物学的プロセス、細胞構成要素、分子機能の 3 つのカテゴリにグループ化されました (図 2)。 S. fulviventer と S. hispidus の両方の遺伝子は、関連する GO の比率が同様でした。 生物学的プロセスに関する GO の上位には、「細胞の窒素化合物の代謝プロセス」 (~ 25%)、「DNA 代謝プロセス」 (~ 17%)、「輸送」 (~ 16%)、および「解剖学的構造の発達」 (~ 15%) が含まれていました。 (図2A)。 細胞構成要素のGOは、大部分が「細胞小器官」（約38％）、「細胞質」（約24％）、「サイトゾル」（約18％）、「核」（16％）で構成されていました（図2B）。 最も一般的な分子機能 GO には、「ヌクレオチジルトランスフェラーゼ」 (~ 15%)、「ヌクレアーゼ」 (~ 15%)、「酵素結合」 (~ 9%)、および「核酸結合」 (RNA = 8%、DNA = 8) が含まれます。 ％）（図２Ｃ）。

シグモドンのトランスクリプトームの注釈。 (A) 生物学的プロセス、(B) 細胞成分、および (C) 分子機能 x 軸上の SwissProt 遺伝子オントロジー (GO) 用語 (図の凡例に示されている重複を含む各カテゴリー内の GO の合計) と GO の数 (割合)合計約 107,000 件の注釈付き転写産物）を Y 軸に表示。 GO は Trinotate v.3.2.2 を使用して TrEMBL/SwissProt データベースに対して割り当てられます。 (D) 上位 25 の KEGG および (E) 免疫系特異的経路を X 軸に、タンパク質をコードする遺伝子の総数を Y 軸に表示。 TransDecoder が決定した CDS に続いて GhostKOALA (https://www.kegg.jp/ghostkoala/) を使用して割り当てられた経路。

同定されたKEGG経路の大部分は代謝とシグナル伝達、特に二次代謝産物生合成、リガンド/サイトカイン/金属受容体の相互作用、およびさまざまなシグナル伝達経路に属していた（図2D、「シグナル伝達と膜輸送」KEGGの分布については図S1Aも参照）通路）。 我々は、ケモカインシグナル伝達、先天性および適応細胞受容体シグナル伝達、補体カスケード、リンパ球分化など、de novo トランスクリプトームで同定された多数の関連遺伝子を示すために、免疫特異的 KEGG 経路を調べました (図 2E)。 KEGG はまた、コットンラットでモデル化に成功した感染因子、つまりインフルエンザ 18、HIV-129、麻疹 22 など、多くの感染経路に対する遺伝子マッピングも提供します (図 S1B)。 我々は、S. fulviventer と S. hispidus の両方の遺伝子アノテーションを、インフルエンザ感染の KEGG 経路に関連する宿主遺伝子にマッピングしました。これには、インフルエンザ感染時に必要な遺伝子の 94.3% が含まれていました (図 3)。 他のすべての経路は、補足ファイル 4 に含まれるデータを使用して、KEGG の再構築ツール (https://www.kegg.jp/kegg/mapper/reconstruct.html) を使用して再構築および視覚化できます。

インフルエンザ疾患経路 (京都遺伝子とゲノム百科事典 [KEGG] から改変)。 インフルエンザの病因の 105 個の必須遺伝子のうち 99 個が正常に組み立てられ、S. fulviventer および S. hispidus の de novo トランスクリプトームに注釈が付けられました。 BioRender で作成されました。

我々は、S. fulviventer および S. hispidus に 105 PFU の RSV A/Long または PBS (模擬感染対照として) を鼻腔内感染させ、感染後 5 日後に分析のために肺を採取しました。 感染は、RSV GおよびF mRNAを標的としたqRT-PCRによって確認され、感染動物では有意に高いRNAコピーが見出されましたが、非感染対照ではウイルスRNAの増幅がありませんでした（図4A）。 5 日間の感染後、S. fulviventer と S. hispidus の間にウイルス RNA レベルに有意差はありませんでした (p = 0.3491、Tukey の多重比較検定)。 肺組織は、組織病理学について評価され（図４Ｂ）、方法に記載されているように４つの炎症パラメータについて盲検的にスコア付けされた：細気管支周囲炎、血管周囲炎、間質性肺炎および肺胞炎（図４Ｃ）。 各感染動物は、非感染対照と比較して有意に大きな累積病理スコアを有し、感染が成功したことを示した（Sf p = 0.0020、Sh p = < 0.0001、Tukey の多重比較検定）（図 4C）。 次に、記載されているように RNA の配列が決定され、リードは各種について事前に注釈が付けられた参照トランスクリプトームとアラインメントされました。 発現正規化後の遺伝子発現解析により、RSV 感染により発現パターンが大きく変化することが示されました。 S. hispidus の肺における RSV 感染は、S. fulviventer よりも遺伝子発現に大きな変化をもたらしました (補足図 2)。

RSV による肺環境の変化。 (A) qRT-PCR によって測定された非感染肺および感染肺におけるウイルス力価 (RSV G および F タンパク質) をβ-アクチンに対して正規化したもの。 y 軸上の変化倍数 (2−ΔΔCT によって計算)。 (B) S. fulviventer および S. hispidus 由来の健康な肺組織 (n = 4/種) と RSV 感染肺組織 (n = 5/種) の両方について、組織病理学的画像処理および (C) 盲目的に作成された病理スコアリング。 （D、E）肺組織（図ABから画像化された同じ組織）から組み立てられた遺伝子のDESeq2分析により、健康な組織と感染した組織の間で差次的に発現（DE）するいくつかの遺伝子が明らかになりました（p < 0.05、q < 0.05、l2fc >|1.0| ) の S. fulviventer (青) と S. hispidus (赤) の遺伝子であり、そのうちのいくつかの遺伝子は Trinotate を使用して正常にアノテートされました (ボックス内に示されているように)。 *p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001、****p ≤ 0.0001。

遺伝子差次的発現解析（RSV A/Long 対疑似感染対照）により、各ワタラット種に固有および共通の遺伝子を含む、感染肺において示差的に上方制御および下方制御されるいくつかの遺伝子が同定された（図4D）。 S. fulviventer における RSV 感染により、325 個の固有の上方制御遺伝子 (98 個の注釈付き) および 140 個の固有の下方制御遺伝子 (20 個の注釈付き) が生じました。 S. hispidus における RSV 感染により、750 個の上方制御遺伝子 (44 個の注釈付き) および 245 個の下方制御遺伝子 (8 個の注釈付き) が生じました (図 4D、E、完全なデータは補足ファイル 5)。 両種の感染データを組み合わせることで、両種で 276 個の遺伝子 (注釈付き 12 個) が上方制御され、一方、両種で 9 個の遺伝子 (注釈付き 0 個) が下方制御されていることがわかりました。 各種の注釈付き遺伝子のみがさらなる分析のために選択されました。 差次的に発現される注釈付き遺伝子の上位 20 個 (機能および遺伝子オントロジーに基づいて選択) を表 2 (S. fulviventer) および表 3 (S. hispidus) に示します。

S. fulviventer では、免疫グロブリン構造 (HVM44)、転写因子 (CREB1、CRY1)、上皮構造の完全性 (K2C8)、密着結合の形成と維持 (OCLD)、膜輸送調節 (CPNE3) に関連するいくつかの遺伝子が感染時にダウンレギュレートされました。 、標的化された RNA 分解 (MOV10)、および組織リモデリングと恒常性 (MFGM)。 RSV G タンパク質である GLYC は、非感染グループに読み取りがないため、RSV 肺で上方制御されているとマークされました (DESeq2 ベース平均 = 0 によって示されます)。 上方制御された宿主遺伝子は、補体系（CFAB）、免疫受容体シグナル伝達（UN93B）、小胞輸送（EXOC5）、インターフェロン誘導性抗ウイルス活性（MX2、CXCL10、I27L2、OAS1A、IIGP1、ISG15）、プロスタグランジン代謝（PGDH）に関連していた。 、電子輸送 (COX1)。 RSV 感染後に差次的に発現されるこれらの S. fulviventer 遺伝子を表 2 に示します。

S. hispidus では、注釈付き遺伝子 1 つだけがダウンレギュレートされました。LMTD1 は細胞増殖に関与します。 他の下方制御された遺伝子には、シグナル伝達ペプチド（SignalP経由）および膜貫通領域（TmHMM経由）が含まれていることを示す注釈がありましたが、機能は不明でした（補足ファイル5）。 S. hispidus で上方制御されたいくつかの免疫遺伝子は、S. fulviventer でも上方制御されました (I27L2、CXCL10、MX2)。 ほとんどの上方制御された遺伝子は、抗ウイルス活性のサイトカイン刺激 (OAS3、CXCL11、IRF9、IFIT1、NLRC5)、プロテアソーム分解 (PSB9)、ストレスに応答した細胞骨格再構成 (SYWC、K2C6A)、T 細胞活性化 (HSH2D、LY6E)、転写後制御（ABEC1）、ウイルスタンパク質分解（RSAD2/Viperin）、補体経路（CO4A、C4BPA）、化学代謝（GBP4）、および細胞防御関連シグナル伝達（LG3BP）。 RSV 感染後に差次的に発現されるこれらの S. hispidus 遺伝子を表 3 に示します。

RSV 感染後の差次的発現遺伝子 (DEG) のうち、12 個の DEG が S. fulviventer と S. hispidus の両方で上方制御または下方制御されることが判明しました。 ケモカイン CXCL10、MX2、および I27L2 は、両方の種において上方制御される遺伝子の上位 10 に入っていました。 有意性しきい値内の他の DEG には、GBP2、GBP4、IRF9、NLRC5、OAS3、PAR14、RN213、SYWC、および IIGP1 が含まれます。 すべての DE は補足ファイル 5 にあります。

さらに、差次的に発現される遺伝子オントロジー (GO) 用語は、GoSeq R パッケージ 46 を使用して決定されました。 S.フルビエンター菌（図5A）とS.ヒスピダス菌（図5B）の両方の感染肺に豊富に含まれる上位のGOは、サイトカインやインターフェロンβへの反応、免疫系プロセス、細胞表面受容体シグナル伝達経路などの「生物学的プロセス」でした。 、およびウイルスプロセス。 イオン結合、触媒活性、加水分解酵素活性などの「分子機能」、および細胞内膜に囲まれた細胞小器官や核などの「細胞構成要素」。 感染した肺における他の濃縮されたGOは、膜や小胞の成分、ストレスへの応答、アポトーシスプロセスの調節、ウイルスゲノム複製の調節、白血球の活性化、炭水化物などの結合など、細胞の成分と機能の増強に関連していた。有機化合物。 健康な組織では S. hispidus だけが GO を濃縮しており、これらにはグアニル-ヌクレオチド交換因子複合体に関与する細胞成分が含まれていました。

Gene Ontology (GO) アノテーションと GoSeq を使用した、(A) S. fulviventer と (B) S. hispidus の両方における RSV 感染後の遺伝子発現の分類的変化。 Y 軸上の SwissProt GO 用語 (生物学的プロセス [青]、細胞成分 [緑]、または分子機能 [赤] に基づいて色調整)、X 軸上の GO の相対発現 (GeneRatio として表現)すべての重要な GO における差次的に発現された遺伝子の総数に対する、各 GO カテゴリーにおける示差的に発現された遺伝子の割合）。 陽性 GeneRatio = RSV 感染肺に豊富。 負の GeneRatio = 健康な肺に豊富に含まれます (健康な S. fulviventer には有意な GO はありません)。 すべての GO は統計的に有意でした (p < 0.05、q < 0.05)。

DEG を確認するために、感染後 5 日目のアップレギュレーションに基づいて 3 つの de novo アセンブリ遺伝子が選択されました (Shisp_DN132151_c0_g1 [IIGP1]、Shisp_DN12103_c7_g1 [I27L2]、Sfulv_DN158_c1_g1 [IIGP1])。 SYBR グリーンを使用した qRT-PCR は、各遺伝子を標的とするように設計されたプライマーを使用して実行され、β-アクチン ハウスキーピング遺伝子に対して正規化されました。 3 つの遺伝子には、S. fulviventer と S. hispidus の両方に IIGP1 が含まれ、S. hispidus には I27L2 が含まれていました。 qRT-PCRにより、RNA-Seqデータと相関するRSV感染後の遺伝子アップレギュレーション（すなわち、正の倍率変化）が確認されました（補足表2）。

さらに、Rajagopala et al.27 によって公表された差次的発現解析をさらに確認および検証するために、S. hispidus が同じ施設内で同じ株および濃度のウイルスで RSV A/Long に感染した場合、本研究で特定された DEG と比較しました。サンプルは異なる日に収集されましたが。 Rajagopala et al.27 の研究には 2 つの時点が含まれていました。 感染後 4 日目と 6 日目ですが、この研究では 5 日目にのみサンプルを収集しました。ただし、両方の研究で使用された DESeq2 分析パラメーターは同じです。 Rajagopala et al.27 と比較すると、この最新の研究では、4 日目に改変された 5 つの真核生物 DEG (IFIT1、MX2、OASL2、RSAD2) のうち 4 つが確認されました。同様に、この研究では、RSV 感染後の 81 の DEG のうち 29 が確認されました ( CFAB、GBP2/4/5/6、IFIT1、IIGP1、K2C6A、MX2、OASL2、RSAD2を含む;補足ファイル5の全データ）6日目に変更されました。

コットンラットは、RSV やその他のウイルスの感染を研究するための優れた前臨床動物モデルですが、どちらの種についてもゲノムが公開されていないため、コットンラットの遺伝的またはトランスクリプトーム解析は限られています。 この研究では、ワタラットの 2 つの近交種、S. fulviventer と S. hispidus の複数の臓器から包括的なトランスクリプトームを生成しました。 我々の 2 つのトランスクリプトーム参照を比較すると、注釈付き遺伝子の総数と機能カテゴリー (遺伝子オントロジー、KEGG 用語) は類似していましたが、各種間で転写配列の相同性とベースライン遺伝子発現レベルに大きな違いがあることが明らかになりました (表 1)。

私たちのトランスクリプトームのアセンブリとアノテーションは、以前に公開された他の動物のトランスクリプトーム参照の品質と完全性の基準を上回っています 35,36,47。 また、複数の組織が含まれているため、トランスクリプトーム アセンブリの品質と深さは、S. hispidus 肺組織の以前の肺トランスクリプトームよりも向上しました 27。 これにより、S. hispidus では注釈付き転写産物の数がほぼ 3 倍になり (117,153 対 38,736)、さらに 6,169 個の固有の遺伝子注釈が追加されました。 さらに、RSV によって誘発される遺伝子発現の変化を推測するためのトランスクリプトーム参照の我々の応用は、RSV、インフルエンザ、その他の呼吸器ウイルスを含む多くの感染症の研究と治療における我々の参照の有用性を示しています。

私たちの分析により、これまで RSV 感染と免疫に関与していると考えられていた多くの遺伝子が確認されました。 RSAD2 (または Viperin) は、S. hispidus における RSV 感染時に有意に上方制御される遺伝子で、ウイルスタンパク質の発現を阻害することなく RSV フィラメント形成と細胞間ウイルス伝達を阻害します 48。 ビペリンは、ライノウイルスによる鼻腔内攻撃後のヒト鼻上皮で最も上方制御される遺伝子でもあります 49。 もう 1 つの RSV 関連遺伝子は I27L2 です。これは、S. ヒスピダスおよび S. フルビエンターで最も上方制御される遺伝子であり、重篤な RSV 感染症の早産児で最も発現量が異なる遺伝子でもあります 50。 RSV 感染に関与することが示されている他の上方制御遺伝子には、ケモカイン CXCL1051、CXCL1152、LY6E53、MX254、OAS1A55、ISG1556、IRF957、NLRC558、および K2C6A59 が含まれます。 また、RSV60、61 に対する宿主応答に関与する補体系 (CFAB、CO4A、C4BPA) およびプロスタグランジン代謝 (PGDH) に関与する遺伝子も同定しました。 私たちの研究結果は、RSV に対する宿主媒介防御におけるこれらの遺伝子の重要性と、ウイルス研究におけるワタラットの翻訳的価値を裏付けています。

CRY2 (S. fulviventer で下方制御されている) も、RSV 疾患の重症度に間接的に起因すると考えられています。 CRY2 は、ウイルス複製に必須の細胞因子の推定調節因子である BMAL1 の抑制を通じて概日リズムを調節する転写因子です 62。 BMAL1-/-初代細胞の分析により、BMAL1の発現が低いと、インフルエンザ63、パラインフルエンザウイルス3、およびRSV64に対する感受性が高まることが明らかになった。 BMAL1 はヒトでも季節変動を示し、呼吸器ウイルスのピークシーズンである冬季にレベルが最も低くなります62。 この遺伝子は、RSV の病因における役割についてさらなる研究が必要ですが、これは RSV 感染時の調節された発現との最初の関連性です。

コットンラットは、他の実験用げっ歯類（例えば、ハツカネズミ）には存在しないヒト相同遺伝子、すなわちインターフェロン刺激されたMX遺伝子の存在により、ヒトの呼吸器感染症を模倣します65。 我々の分析は、前述したように、RSV 感染時の S. fulviventer と S. hispidus の両方における MX2 (および S. fulviventer の MX1、MX1B、および MX3) の上方制御と一致しており 66、インターフェロンを捕捉する際のこのモデルの重要性を強調しています。 RSウイルスや他のウイルスに対する免疫反応を誘導します。 さらに、我々の分析では、S. fulviventer および S. hispidus における IIGP1 の上方制御も捕捉しています。 IIGP1 は、Mx 遺伝子と同様の重要性と機能を持つもう 1 つのヒトのインターフェロン刺激遺伝子ですが、効果の低いパラログ IGPT67 としてマウスにのみ存在します。 IGPT欠損マウスに関する研究では、リステリアやサイトメガロウイルスなどの細胞内病原体に対する感受性の増加やインターフェロン誘発性のサイトカイン産生は見られず、これはマウスにおける異なる上流機構を示唆している68。 我々は初めて、コットンラットにおけるIIGP1の注釈付けに成功し、RSV感染時のIIGP1の調節を示した。 機能検証研究が必要である一方で、我々の研究結果は、IIGP-1欠損マウスと比較して、RSVや他の呼吸器ウイルスのモデルとしてコットンラットのトランスレーショナル有用性をさらに主張している。

CREB1 (cAMP 応答性エレメント結合タンパク質 1) は、多くの免疫遺伝子を調節する転写因子で広く研究されており、S. fulviventer では RSV 感染時に下方制御されました。 CREB1 は、NF-κB 活性の阻害、IL-10 の誘導、Treg69 の生成などの抗炎症反応を促進します。 CREB1 の活性化は、CD4 + T 細胞および B 細胞を抗原提示部位に動員することにより、非ヒト霊長類における HIV-1 ワクチンのワクチン効果のドライバーであることが観察されました 70。 RSV と CREB1 の間に関連性があるかどうかをさらに理解するには、今後の機能研究が必要です。

S. fulviventer と S. hispidus の両方でさらに興味深い上方制御される遺伝子の 1 つである SYWC は、ERK、Akt、および eNOS 経路とストレスに応答した細胞骨格再構成のインターフェロン誘導性活性化因子であり、肺結核の血清マーカーです 71。 この研究はSYWCとRSV感染症との最初の関連性であるが、さらなる研究によりSYWCが組織および血清中の重篤なRSV感染症のマーカーとして明らかにされる可能性がある。

私たちはワタラットのトランスクリプトームの包括的な概要を提示しましたが、私たちの研究にはいくつかの限界があることを認識しています。 Pletneva et al. から以前に公開されたデータ。 は、さまざまな RSV 株および分離株が、コットンラットにおいてインターフェロン活性化遺伝子の異なる誘導を示すことを示しました 66。 一方、Pletnevaらによる研究は、 にはS. hispidusのみが含まれていますが、RSV A/Longに対する同様の感受性のため、これはS. fulviventerにも当てはまると予想されます。 この目的のために、我々は、我々の結論が RSV A/Long に限定されており、RSV 変異体のトランスクリプトーム比較が今後の研究で考慮されるべきであることを認識しています。 さらに、これまで RSV 感染に関与していなかった複数の遺伝子 (LG3BP、SYWC、ABEC1、IIGP1、CREB1) を同定しました。 私たちの分析は潜在的に未知の病因メカニズムを示唆していますが、実験データがないため、これらの遺伝子とRSV感染との関連は非常に限定されていると認識しています。 このような取り組みは、参照ワタラットのトランスクリプトームに関するこの論文の範囲を超えていますが、将来の研究で考慮されます。

この報告書は、入手可能なゲノム参照がない場合の感染誘発性トランスクリプトーム変化を理解するためのコットンラットのトランスクリプトームの有用性を強調しています。 S. hispidus と S. fulviventer の両方のトランスクリプトーム参照は、追加研究のために BioProject PRJNA816878 で公開されています。 さらに、遺伝子配列の同定により、コットンラットの遺伝学の理解が深まり、目的の遺伝子を標的とする qRT-PCR プライマーやプローブ、組換えタンパク質、抗体、その他のアッセイなどの分子ツールの生成が可能になります。 差次的遺伝子発現解析により、RSV 感染時の宿主種特異的な違いが明らかになりました。 RSV治療薬の開発には、RSVの十分に開発された堅牢な前臨床モデルが必要であるため、我々のトランスクリプトームリファレンスとRSVとの遺伝子関連性が、公衆衛生上重要なこの病原体に対する生物医学的介入を促進できることを期待しています。

生後 4 ～ 6 週間の S. hispidus (n = 8 雄、1 雌) および S. fulviventer (n = 8 雄、1 雌) コットンラット (約 100 g) を、Sigmovir Biosystems で維持されている近交系コロニーから入手しました。コロニー内のコットンラットは、ELISA により外来性呼吸器ウイルス (すなわち、マウスの肺炎ウイルス、ラットパルボウイルス、ラットコロナウイルス、センダイウイルス) に対して血清陰性でした。 各種をランダムに 2 つのグループ、RSV 感染群 (n = 5) と非感染対照群 (n = 4) に分けました。 トランスクリプトームのアセンブリと注釈付けは、各非感染グループ内の 2 人の男性のすべての組織 (全肺、大腸、心臓、脾臓、腎臓) に対して実行されました。 雌動物は RSV 感染グループにのみ含まれていました。 争いを避けるために、すべての動物を大きなポリカーボネート製ケージに個別に収容し、標準的なげっ歯類の餌と水を自由に与えました。 すべての動物手順は、Sigmovir Biosystems, Inc. IACUC によって承認された NIH および USDA ガイドラインに従いました。 研究デザイン、分析、方法と結果の報告は、ARRIVE ガイドラインに従って提示されます。

RSV A/Long の Long 株 (ATCC Cat. # VR-26) を HEp-2 細胞で増殖させ、プラークアッセイを使用してウイルス力価を測定しました。 コットンラットに、イソフルラン麻酔下で、RSV 懸濁液または PBS ビヒクルのいずれか 100 μL 中の 105 プラーク形成単位を鼻腔内接種しました。 感染５日目に動物を二酸化炭素吸入により屠殺した。 全肺、大腸、心臓、脾臓、腎臓をすべての動物から解剖し、VUMC での処理と配列決定のために RNA-later (Invitrogen AM7021) で凍結しました。

肺（右葉）を解剖し、１０％中性緩衝ホルマリンで膨張させ、固定のためにホルマリンに浸漬した。 肺をパラフィンブロックに包埋し、切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）で染色した。 病理学者には研究グループのことを知らせず、前述したように肺免疫細胞の浸潤と炎症の 4 つのパラメータについてスライドを検査した72：細気管支周囲炎（細気管支）、血管周囲炎（小血管）、間質性肺炎（肺胞壁）、および肺胞炎（肺胞腔） ) (重大度が最も低いものから最も高いものまでリストされています)。 各状態には 0 から 4 のスコアが割り当てられました。0 は病状なし、4 は最大の病状です。 スコアは、図 4A に示されている視野内に存在する病変の割合に対応します (0 = 0%、1 = 5%、2 = 25%、3 = 75%、および 4 = 100%)。 累積病理スコアは、各状態の中央値スコアを合計することによって計算されました。

ウイルス RNA のコピー数は、肺 (舌葉) ホモジネートから抽出した RNA からリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (qRT-PCR) を使用して決定しました (抽出方法については、次のセクション「RNA 抽出および cDNA ライブラリーの調製」を参照)。 抽出後、1μgの全RNAおよびSuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen™)キットを製造業者の指示に従って使用してcDNAを生成しました。 cDNAを1:5に希釈し、iQ™ SYBR® Green Supermixを使用したqPCR反応に3uLを加えました（合計10uL）。 RSV の G および F mRNA と β-アクチンを標的とするプライマー (IDT、最終濃度 250 nm) を使用して、各標的の反応をサンプルごとに 2 回ずつ実行しました。これらのプライマーは、以前に発表され、両種のワタラットでの使用が検証されています 73。 テンプレートなしの対照および陽性対照（感染に使用したRSV A/Longウイルスストックから抽出したRNA）を各プレートで実行しました。 G と F の両方の CT 値を平均し、β-アクチンに対して正規化しました。 結果は 2-ΔΔCT 法 74 を使用して計算されました。 数値と統計分析は、Prism 8 の ANOVA/Tukey の多重比較検定を使用して実行されました。

RNA は前述のように調製されました 27。 要約すると、コットンラットの肺 (舌葉)、大腸 (約 20 mm の結腸、滅菌 PBS で洗い流した)、脾臓、腎臓、心臓の小切片を、3.2 mm の RED RINO™ チューブを備えた NextAdvance Bullet Blender® を使用してホモジナイズしました。ステンレススチールビーズ (SSB32) と 2 倍量の QIAzol® Lysis Regent (Qiagen、カタログ番号 79306) を最大速度で 3 分間使用します。 RNeasy® Plus Universal Mini kit (Qiagen、カタログ番号 73404) を使用し、追加の QIAzol® (総容量 900uL)、gDNA エリミネーター、およびメーカーのプロトコールに従ってカラム DNase 消化によるクロロホルムを介して、ホモジネートから RNA を抽出しました。 RNA の品質は、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies、カリフォルニア州、米国) を使用して測定しました。 NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (カタログ番号: NEB E7400X) を使用して、宿主 rRNA を除去しました。 cDNA ライブラリは、インタクトな RNA (RIN > 7) についてはメーカーのプロトコルに従い、イルミナ用 NEBNext Ultra II RNA ライブラリ調製キット (カタログ番号: NEB E7805L) を使用し、クリーンアップ ステップには AMPure XP ビーズを使用し、各サンプルからの合計 RNA 1 μg を使用して調製しました。 (Beckman、カタログ番号 A63881)、およびプールサンプル用の NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (セット 1、カタログ番号: E7600S)。 シーケンスは、Vanderbilt Technologies for Applied Genomics (VANTAGE) の中核施設で Illumina NovaSeq6000 2 × 150 bp シーケンスを使用して実行されました。

次に、データはバーコードによって個々のサンプルに解析されました。 アダプター配列、低品質 (最小 Phred 33)、および短い (< 75 bp) リードは、Trimmomatic (バージョン 0.36、「ILLUMINACLIP: NEB_multiplexoligos.fa:2:30:10 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75)」を使用して削除されました。 ")75。 76 に記載されている品質閾値を超えたペアエンドリードのみが保持されました。

Trinity v2.13.1 ソフトウェア パッケージ 31 を使用し、デフォルト パラメータ 50 × カバレッジを使用して、健康な組織からの約 9 億 2,100 万のペアエンド リードを de novo トランスクリプトーム アセンブリに利用しました。 ウイルス感染肺からの追加の 3 億 1,450 万個のペアエンドリードが実験分析に使用されました。 最初に個々のコンティグ/転写物を「遺伝子」にクラスタリングし、続いて全長の選択的にスプライシングされたアイソフォームを報告するためのデ・ブルーイン・グラフを構築することによって、S. fulviventer および S. hispidus のコンティグを組み立てました。 次に、SeqKit32 を使用した 200 bp 未満の転写物長カットオフ、汚染物質のアノテーション (「ウイルス」、「細菌」、または「真菌」の Blast アノテーション)、CD-HIT33 を使用した 95% 以上の配列類似性、および除去によってすべての転写物をフィルター処理しました。 EvidentialGene tr2aacds パイプラインによって選択された冗長 mRNA の数 34。 平均転写産物数、転写産物長、平均転写産物長、N50などの最終転写産物のアセンブリ統計を表1に示します。生のリードとアセンブリデータは、出版用の原稿が受理され次第、BioProject PRJNA816878の下でSRAに保管されます。

RSEM パッケージは、ペアエンド RNA-Seq データからの遺伝子とアイソフォームの存在量を定量化し、正規化するために使用されました 77。 RSEM を使用すると、参照ゲノムを使用せずに、サンプルおよびサンプルの種類ごとに正確な転写産物の定量が可能になります。 TPM (マッピングされたリード 100 万件あたりの転写産物) は、Bowtie2 アライナーを備えた RSEM パッケージを使用して計算され、TPM > 1 のカットオフを使用して、発現差解析に使用する低品質のアセンブルされた転写産物をフィルター処理しました。 Ex90N50 は、Trinity contig_ExN50_statistic.pl スクリプトを使用して計算されました。

Trinotate v3.2.2 アノテーション パイプラインを使用して、S. hispidus と S. fulviventer の両方の転写産物にアノテーションを付けました。 BlastX および BlastP (1e-05 の e 値カットオフ)42 を使用して、UniProt/SwissProt データベース 41 に対する個々のコンティグおよびタンパク質コード領域 (Transdecoder、https://github.com/TransDecoder/TransDecoder によって決定) の配列相同性を見つけました。 (データは補足ファイル 6 にあります)。 Swissprot41 データベースからの KEGG 用語 43、Gene Ontology 用語 44、EggNOG 用語 45 と BLAST42 のアラインメント。 パイプライン内の他のツールは、Pfam78 を介したタンパク質ドメイン、TmHMM79 を介した膜貫通ヘリックス、およびシグナル伝達タンパク質 80 に基づいて転写物に注釈を付けました。

RSV感染群および非感染群から単離した肺を、上記のように処理し、配列決定した。 Trinotate パイプラインを使用して、実験グループからのすべての読み取りに参照に対して注釈を付けました。 組織全体の転写産物の正規化された発現レベルは、Salmon81 および TPM (100 万あたりの転写産物) メトリクスを使用して決定されました。 TPM > 1 の転写物のみを下流の差次的発現解析に使用しました (S. fulviventer = 270,451、S. hispidus = 474,882)。 各種の遺伝子レベルでの生のカウント行列は補足ファイル 7 にあります。DESeq2 パッケージ 38 は、生物学的複製を含む実験グループ (RSV 感染肺) と対応する対照グループ (非感染肺) を比較するためにパイプライン内で使用されました。 ap < 0.05、調整済み p < 0.05 (「q」/偽発見率/Benjamini-Hochberg)、および log2 倍率変化 >|1| の遺伝子。 差次的に発現されたものとして扱われた。 我々は、Bioconductor の goseq パッケージを使用して、異なって豊富な GO 用語を検出しました44。 ｐ＜０．０５および調整されたｐ＜０．０５（「ｑ」／偽発見率／ベンジャミニ・ホッホバーグ）を有するＧＯは、示差的に発現されたものとして扱われた。

肺組織から抽出した RNA を qRT-PCR アッセイに使用しました。 上記のように、SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen™) キットおよび iQ™ SYBR® Green Supermix を使用して、qRT-PCR を二重に実行しました。 qRT-PCR プライマーは、de novo アセンブリおよび示差的発現解析に基づいて、ランダムに選択された 3 つの上方制御遺伝子用に設計されました (Shisp_DN132151_c0_g1、Shisp_DN12103_c7_g1、Sfulv_DN158_c1_g1)。 プライマーは、Primer3Plus82 を使用して設計され、補足表 2 に報告されています。テンプレートなしのコントロールを各プレートで実行しました。 技術的複製 CT 値を各遺伝子について平均し、β-アクチン ハウスキーピング遺伝子に対して正規化しました。 結果は、2-ΔΔCT 法 74 を使用して、非感染肺に対する誘導倍数として計算されました。 さらに、遺伝子の差次的発現をさらに確認するために、同じ DESeq2 有意パラメーター (p < 0.05、q < 0.05、l2fc >| 1.0|)。

この研究には人間の被験者は参加しませんでした。 すべての動物手順は NIH および USDA ガイドラインに従い、Sigmovir Biosystems, Inc. IACUC によって承認されました。

配列決定データは、BioProject PRJNA816878 に基づいて原稿が受理されると、NCBI Short Read Archive (SRA) に保管されます。 その他の詳細については、特定のデータ要求については対応著者にお問い合わせください。

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コットンラットの飼育、取り扱い、世話をしていただいた Sigmovir Biosystems Inc. の ABSL2 技術者 Charles Smith 氏と Martha Malache 氏に感謝します。 サンプルの QC と配列決定については、VANTAGE の Angela Jones とその他の方々に感謝します。

この研究は、国立アレルギー感染症研究所からの資金によって支援されました (賞番号 R21AI142321-02S1、R21AI142321、R21AI154016、および R21AI149262)。 この研究は、JCGB への助成金 AI163543、AI109926、AI125215 によって支援されました。 疾病管理予防センター (CDC) 75D3012110094; National Heart, Lung, and Blood Institute (受賞番号 K23HL148638 および R01HL146401) および Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics Core (国立衛生研究所からの助成金支援 (受賞番号 UL1RR024975、P30CA68485、P30EY08126、および G20RR030956))。 内容は著者のみの責任であり、必ずしも資金提供機関の公式見解を表すものではありません。

米国テネシー州ナッシュビル、ヴァンダービルト大学医療センター病理学微生物学および免疫科

ブリットン・A・ストリックランド & スーマン・R・ダス

ヴァンダービルト大学医療センター医学部感染症部門、1211 21st Avenue South、S2108 Medical Center North、ナッシュビル、テネシー州、37232、米国

シーサンドラ・V・ラジャゴパラ、メーガン・H・シルツ、スーマン・B・パカラ、スーマン・R・ダス

Sigmovir Biosystems Inc.、9610 Medical Center Drive、Suite 100、Rockville、MD、20850、米国

アラシュ・カマリ、マリーナ・S・ブクバロワ、ホルヘ・CG・ブランコ

米国フロリダ州オーランド、セントラルフロリダ大学ゲノミクス・バイオインフォマティクスクラスターコンピューターサイエンス学部

シブ・ヨセフ

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BAS、SVR、SY、JCGB、および SRD が研究デザインに貢献しました。 AK と MSB は動物実験とサンプル収集に貢献しました。 BAS はサンプルの処理と配列決定に貢献しました。 BAS は SVR、MHS、SBP、SYJCGB からの相談を受けて生物情報学および統計解析に貢献し、SRD はこの研究を支援する研究資金を獲得しました。 BAS と SRD が原稿の初期バージョンを作成し、すべての著者が最終バージョンをレビューして承認しました。 著者全員が原稿を確認し、出版に同意しました。

ジョージ CG ホワイトまたはスマン R. ダスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Strickland、BA、Rajagopala、SV、Kamali、A. 他コットンラットにおけるRSウイルス感染時の種特異的なトランスクリプトーム変化。 Sci Rep 12、16579 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-19810-4

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受信日: 2022 年 5 月 27 日

受理日: 2022 年 9 月 5 日

公開日: 2022 年 10 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19810-4

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科学レポート (2023)

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